Исследование основных генов и скрининг ключевых микроРНК препарата Хуанцинь Хуанлянь для лечения пептических язв, ассоциированных с Helicobacter pylori
Язвенная болезнь (ЯБ) - одно из самых распространенных в клинической практике заболеваний пищеварительной системы, которое, как правило, возникает в желудке и двенадцатиперстной кишке. Уровень заболеваемости ЯБ в разных странах и регионах неодинаков. Исследования показывают, что около 5%~10% людей в мире страдали от язвенной болезни в течение жизни. Клинические данные показывают, что пациенты с язвенной болезнью составляют от 10,3% до 32,6% случаев гастроскопии в Китае. Типичным симптомом большинства пациентов с ЯБ является периодическая ритмичная боль в верхней и средней части живота; у некоторых пациентов симптомы не отличаются специфичностью и проявляются в виде гастроинтестинальных симптомов, таких как дистензия верхней части живота, анорексия и кислотный рефлюкс; у небольшого числа пациентов основными симптомами являются осложнения ЯБ, такие как желудочно-кишечное кровотечение и перфорация. С ростом экономического уровня Китая, улучшением качества жизни людей и ускорением темпов работы, уровень заболеваемости ПЯ становится все выше и выше, что оказывает серьезное влияние на физическое и психическое здоровье и качество жизни пациентов.

С тех пор как в 1983 году австралийские ученые Уоррен и Маршалл выделили Helicobacter pylori (Hp) из биоптатов слизистой оболочки желудка пациентов, было подтверждено, что Hp тесно связан с возникновением, развитием и рецидивами ЯБ. Пептические язвы, вызванные инфекцией Hp, также известны как Hp-ассоциированные ПУ. Комбинация антибактериальной терапии антибиотиками и кислотоподавляющей терапии ингибиторами протонной помпы в настоящее время является основным методом лечения Hp-ассоциированных ЯБ. Однако с широким распространением антибиотиков в Китае из года в год растет уровень резистентности Hp к кларитромицину, метронидазолу и левофлоксацину, что приводит к снижению или даже отказу от тройной терапии в устранении Hp. В настоящее время в Китае предпочтительным методом лечения ПВИ, связанных с Hp, является четырехкратная терапия висмутом с курсом 10 или 14 дней. Этот метод также имеет такие проблемы, как повышенная устойчивость к антибиотикам, большое количество побочных реакций, низкая комплаентность пациентов и тяжелое экономическое бремя. Поэтому применение терапии традиционной китайской медицины для расширения плана лечения ПЯ, связанных с Hp, является одной из горячих точек в гастроэнтерологических исследованиях.

Традиционная китайская медицина считает, что ПУ, связанные с Hp, можно классифицировать по категориям "эпигастральная боль", "кислое глотание", "шум" и т. д. Основу патогенеза составляют вторжение патогенных токсинов, дефицит положительной и отрицательной энергии и дисбаланс движения ци. Hp относится к категории "злой ци" и часто обладает патологическими свойствами жара и токсичности. Язвы, вызванные Hp, часто проявляются как синдром влажного тепла. Метод очищения от жара, рассеивания сырости и детоксикации является одним из важных методов лечения ПЯ, связанных с Hp. Coptis chinensis Franch - растение семейства Ranunculaceae (также известное как Weilian), Sanjiaoye Huanglian C Deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao (также известное как Yalian) или Yunlian C Сухие корневища teeta Wall холодные по своей природе и горькие на вкус. Они расположены в меридианах сердца, селезенки, желудка и толстого кишечника и обладают эффектами очищения от жара, осушения сырости, очищения от огня и детоксикации. Scutellaria baicalensis Georgi, растение из семейства Lamiaceae, представляет собой высушенный корень Scutellaria baicalensis Georgi. Он обладает холодным характером и горьким вкусом и находится в меридианах легких, желчного пузыря, селезенки, толстого и тонкого кишечника. Его действие направлено на очищение от жара и сырости, очищение от огня и детоксикацию, охлаждение крови и остановку кровотечений. Лекарственная пара, состоящая из корневища Scutellaria Radix Coptidis Rhizoma (SRCR), является одним из классических средств для очищения от жара и детоксикации в традиционной китайской медицине. Эти два препарата часто используются в комбинации для лечения ГП, связанного с ГП, и имеют определенную клиническую эффективность. Однако в существующих отчетах отсутствует систематическое и всестороннее исследование механизмов регуляции молекулярной сети их активных ингредиентов, мишеней, сигнальных путей и т.д.

Сетевая фармакология - это новая модель исследования лекарств, объединяющая теории из нескольких дисциплин, таких как биоинформатика, системная биология и технология анализа компьютерных сетей. Она позволяет исследовать взаимосвязь между лекарствами и заболеваниями с точки зрения общего гомеостаза биологической сети. Целостные и системные характеристики, представленные сетевой фармакологией, совпадают с принципами целостного взгляда ТКМ, дифференциации синдромов и лечения, а также совместимости ТКМ. В данном исследовании использовались методы сетевой фармакологии и биоинформатики для анализа многокомпонентных, многоцелевых и многопутевых характеристик препарата Хуанцинь Хуанлянь. На основе ключевых генов и ключевых микроРНК был изучен молекулярный сетевой регуляторный механизм препарата Хуанцинь Хуанлянь в лечении Hp, связанного с PU, с целью обеспечения научной основы для его клинического лечения Hp, связанного с PU, и предоставления идей и ссылок для последующих углубленных экспериментальных исследований.

Во-первых, основные активные ингредиенты и потенциальные мишени SRCR были получены с помощью базы данных и платформы анализа системной фармакологии традиционной китайской медицины (TCMSP); получить данные профиля экспрессии генов GSE70394 из базы данных GEO, использовать программное обеспечение R для гомогенизации данных чипа дифференциально выраженных генов (DEGs), вовлеченных в Hp-инфицированные эпителиальные клетки желудка человека (GES), и рисовать DEG вулкан и кластерные тепловые карты; Построить сеть белковых взаимодействий между мишенями компонентов SRCR и DEGs клеток ЖЭС человека, инфицированных Hp, используя базу данных STRING; Выполнить функциональный анализ GO и анализ обогащения путей KEGG для вышеупомянутых характерных генов, используя базу данных DAVID; Затем, Cytohuba был использован для скрининга основных генов, участвующих в SRCR лечении Hp связанных PU; Прогнозирование ключевых микроРНК, регулирующих основные гены, используя базы данных Target Scan и miRBase.

Язвенная болезнь - это заболевание, характеризующееся воспалительной реакцией и некротическим поражением слизистой оболочки под действием различных патогенных факторов. Поражение может проникать в мышечный слой слизистой или достигать более глубоких слоев, чаще всего поражается слизистая желудка и двенадцатиперстной кишки. С момента открытия Нр многочисленные исследования подтвердили, что Нр является наиболее важным фактором, приводящим к возникновению и рецидивам пептических язв. Под язвенной болезнью, связанной с Hp, понимают возникновение, развитие, прогноз и рецидивы язвенной болезни, тесно связанные с инфекцией Hp. Патогенетический механизм язвенной болезни, вызванной Нр-инфекцией, очень сложен и является предметом длительных исследований для клиницистов-гастроэнтерологов. В настоящее время существует четыре основные теории: ① теория протекающей крыши; ② теория, связанная с гастрином и желудочной кислотой; ③ теория желудочной метаплазии; ④ теория промывания среды. В клинической практике обычно используется тройная или четверная терапия, направленная на подавление или уничтожение Helicobacter pylori, снижение уровня желудочной кислоты и защиту слизистой оболочки желудка, что позволяет лечить ПЯ, связанные с Hp. Из-за длительного нерационального использования антибиотиков резистентность Hp растет с каждым годом, что приводит к снижению или даже отказу в лечении тройной или четверной терапией. Кроме того, широкое внимание привлекает влияние программ эрадикации Hp на нормальную микробиоту желудочно-кишечного тракта, например, вызывающее дисбиоз микробиоты или избыточный рост бактерий тонкого кишечника. Поэтому выбор комплексной терапии традиционной китайской медицины для решения проблемы резистентности Hp, уменьшения желудочно-кишечных эффектов и других побочных реакций антибиотиков, а также контроля частоты рецидивов язв имеет важное клиническое значение.

В традиционной китайской медицине нет названия болезни "ПУ, связанная с Hp". Современные врачи классифицируют его как "эпигастральную боль", "глотание кислоты", "шум" и другие категории на основании основных клинических симптомов. Традиционная китайская медицина считает, что существует множество причин эпигастральной боли, в основном это внешние патогены, проникающие в желудок, эмоциональные расстройства, нерегулярное питание и длительная физическая слабость. Hp-инфекция относится к категории экзогенных патогенных ци, а связанные с Hp ПУ часто обладают термическими и токсическими свойствами. Когда селезенка и желудок слабы, а жизненная энергия организма недостаточна, Hp, пользуясь дефицитом, проникает в желудочно-кишечный тракт, вызывая дисгармонию в работе селезенки и желудка, дисбаланс в движении ци и образование различных патологических продуктов, таких как застой ци и влажное тепло, повреждая слизистую, разлагая мышцы и вызывая язвы. Как говорится в книге "Происхождение и источник различных заболеваний: Свеча носорога - Болезни желудка": "Боль в желудке вызвана патогенной сухостью в эпигастральной области. Желудок наполнен ци, способствующей гармонии, с обилием ци и крови. Когда желудок силен, зло не может быть иссушено, а когда он слаб, то становится болезнью. Он имеет тенденцию быть холодным и горячим, с застоем воды и пищи, и все это болезненно из-за борьбы с истинной ци. Результаты большого количества клинических исследований показали, что ПУ, связанная с Hp, чаще встречается при синдроме влажного тепла селезенки и желудка, и лечение, направленное на очищение от тепла и устранение сырости, имеет важное направляющее значение для лечения этого заболевания. Сочетание Хуанцинь и Хуанлянь - это классическая клиническая формула для очищения от жара, устранения сырости и выведения токсинов. Оба препарата относятся к категории средств для лечения горького холода и очищения жара, и их следует использовать вместе, чтобы получить эффект очищения жара, осушения сырости, очищения огня, детоксикации, охлаждения крови и остановки кровотечения. Сочетание Хуанцинь и Хуанлянь также является основной парой препаратов в широко используемых формулах для лечения ГП, таких как Banxia Xiexin Tang, Huanglian Jiedu Tang, Sanhuang Xiexin Tang и т.д. Современные фармакологические исследования показали, что и Scutellaria baicalensis, и Polygonatum sibiricum обладают высоким антибактериальным действием в отношении Hp, а также антиоксидантным, противовоспалительным, жаропонижающим, гипогликемическим, противоопухолевым, защищающим слизистую желудка и регулирующим иммунитет эффектами. Huangqin и Huanglian, два традиционных китайских препарата, обладают схожей эффективностью и фармакологическим действием. Их комбинация часто оказывает синергетическое действие и широко используется в клиническом лечении ГП.

Данное исследование основано на сетевой фармакологии и биоинформатике для изучения основных молекулярно-сетевых регуляторных механизмов лекарства Хуанцинь Хуанлянь в лечении Hp, связанных с PU, и для исследования основных генов и ключевых микроРНК, которые могут играть роль в его фармакологических эффектах. В базе данных TCMSP, 41 активных ингредиентов Huangqin Huanglian лекарственных пар были окончательно проверены, среди которых Huanglian в основном состоит из алкалоидов, а Huangqin в основном состоит из флавоноидов. Дальнейшее исследование выявило 216 потенциальных мишеней и 764 взаимодействия между компонентами и мишенями. В результате обработки и анализа базы данных GEO GSE70394 было получено 127 значительно дифференциально экспрессированных генов между инфицированными Hp эпителиальными клетками слизистой оболочки желудка человека и нормальными эпителиальными клетками слизистой оболочки желудка, включая 77 генов с повышенной регуляцией и 50 генов с пониженной регуляцией. Используя базу данных STRING и программное обеспечение Cytoscape, PPI-сеть действующих веществ-мишеней в препарате Huangqin Huanglian и PPI-сеть значительно дифференциально экспрессированных генов в эпителиальных клетках желудка человека, инфицированных Hp, были объединены, и их пересечение было извлечено для получения PPI-сети препарата Huangqin Huanglian для лечения Hp, связанных с PU. Для дальнейшего анализа возможного механизма действия препарата Huangqin Huanglian при лечении этого заболевания с помощью активных ингредиентов мы провели анализ GO и KEGG обогащения для 127 специфических генов-мишеней в его сети.

Результаты анализа обогащения GO и KEGG включают множество биологических процессов и важных сигнальных путей. Результаты GO-анализа показали, что препарат Huangqin Huanglian играет важную регуляторную роль в таких биологических процессах, как цитокиновый ответ, положительная регуляция активности протеинкиназ, воспалительный ответ, иммунный ответ, отрицательная регуляция клеточной пролиферации и положительная регуляция активности фактора транскрипции NF - κ B. И эти биологические процессы могут быть отражены в сигнальных путях, участвующих в регуляции генов-мишеней препаратом Huangqin Huanglian. Результаты анализа KEGG показали, что 35 сигнальных путей были тесно связаны с лечением Hp, связанного с PU, с помощью препарата Хуанцинь Хуанлянь. Значительно обогащенные сигнальные пути включают путь взаимодействия цитокиновых рецепторов, сигнальный путь NOD-подобных рецепторов, путь молекул клеточной адгезии, сигнальный путь ErbB, сигнальный путь NF - κ B, сигнальный путь Jak STAT и т.д.

NOD-подобные рецепторы - это рецепторы распознавания образов, расположенные в цитоплазме, которые имеют большое значение для предотвращения и лечения внутриклеточных патогенных инфекций и участия во врожденных иммунных реакциях. Хотя Hp является внеклеточным паразитом, он может переносить пептидогликаны в клетки хозяина и стимулировать защитные реакции хозяина при контакте с белком NOD1. Исследования показали, что мыши с дефицитом белка NOD1 более восприимчивы к Hp. NF - κ B - ядерный фактор транскрипции, принадлежащий к семейству белков Rel. После активации он может регулировать транскрипционную экспрессию различных генов и широко участвовать в таких биологических процессах, как воспаление, иммунный ответ, окислительный стресс, пролиферация, дифференцировка и апоптоз клеток в организме. Некоторые исследования показывают, что активация сигнального пути NF - κ B является одним из маркеров Hp-инфекции и играет центральную роль в развитии сопутствующих воспалительных заболеваний и рака. Сигнальный путь Jak STAT является цитокин-стимулированным сигнальным путем, который опосредует активацию NF - κ B и экспрессию IL8 в инфицированных Hp желудочных эпителиальных клетках. Из этого видно, что большое количество исследований подтвердило тесную взаимосвязь между сигнальным путем NOD-подобного рецептора, сигнальным путем NF - κ B, сигнальным путем Jak STAT и Hp-инфекцией, что указывает на определенную точность данного исследования в прогнозировании механизма регуляции молекулярной сети препарата Huangqin Huanglian в лечении Hp-родственных ПУ.

Путь, связанный с рецепторами цитокинов, может регулировать рост и дифференциацию клеток, регулировать иммунный ответ и участвовать в возникновении различных заболеваний, таких как воспаление при определенных условиях. Молекулярный путь клеточной адгезии участвует в прикреплении и перемещении клеток и лежит в основе физиологических и патологических процессов, таких как иммунный ответ, воспалительная реакция, коагуляция и заживление ран. Путь, связанный с цитокиновыми рецепторами, и путь молекул клеточной адгезии тесно связаны с иммунной функцией, но в настоящее время имеется мало сообщений об их связи с инфекцией Hp, что дает новые идеи для будущих исследований. Между сигнальными путями существуют взаимосвязи и пересечения, которые могут расширять их соответствующие функции и формировать сложные регуляторные сети. Препарат Huangqin Huanglian действует не только на эти значительно обогащенные пути, но и на другие пути, связанные с раком, оказывая совместное терапевтическое воздействие на Hp, связанные с ПУ.

Алгоритм MCC Cytohuba был использован для анализа сети PPI препарата Huangqin Huanglian в лечении Hp, связанного с PU. В ходе исследования были выявлены 10 ключевых генов: CXCL8 IL10、IL1B、IL1R1、TNFRSF1B、IL6R、IL10RA、CD28、VEGFA、CD40LG。 Эти основные гены часто связаны с воспалительными и иммунными реакциями. CXCL8, IL1B и IL10 - это воспалительные цитокины. CXCL8, также известный как IL8, является мощным плейотропным цитокином, который может привлекать нейтрофилы к месту воспаления, регулировать иммунные реакции, а также участвовать в пролиферации, миграции и инвазии опухолей. Исследователи совместно культивировали рекомбинантный антиген Helicobacter pylori HP0986 с эпителиальными клетками желудка и обнаружили, что HP0986 может индуцировать секрецию IL8 эпителиальными клетками желудка дозо- и времязависимым образом через NF- κ B-путь. IL1B - важный медиатор воспаления, секретируемый моноцитами/макрофагами, способствующий пролиферации Т- и В-лимфоцитов и активирующий нейтрофилы. Исследования показали, что экзогенное введение 10 нг/мл IL1B может стимулировать пролиферацию клеток, ингибировать апоптоз, вызванный Helicobacter pylori, и подавлять секрецию H+ париетальными клетками путем снижения экспрессии H+- K+- АТФазы, что позволяет предположить, что IL1B играет важную роль в Hp-индуцированном раке желудка. Мета-анализ большой выборки из 21 исследования также предполагает, что полиморфизм гена IL-1B-31C/T может повышать риск заражения Hp, а полиморфизмы генов IL-1B-511-C/T и IL-8-251T/A могут быть факторами риска развития Hp-ассоциированных язв. IL10 является противовоспалительным цитокином, и клинические исследования показали, что его экспрессия значительно выше у Hp-позитивных пациентов с пептическими язвами и гастритом, чем у Hp-негативных здоровых людей. Уровень экспрессии IL10 положительно коррелирует со степенью инфицирования Hp и развитием хронического воспаления.

IL1R1, TNFRSF1B, IL6R и IL10RA - это цитокиновые рецепторы, которые связываются с факторами воспаления, такими как IL1, TNF - α, IL6 и IL10. Цитокины оказывают свое действие, связываясь с соответствующими рецепторами и запуская внутриклеточные сигнальные пути. CD28 является основным ко-стимулирующим рецептором на Т-клетках, и ко-стимулирующий сигнал, генерируемый при его связывании с B7, играет важную роль в активации Т-клеток. CD40LG связывается с CD40 как важнейшим вторым мессенджером для активации В-клеток, способствуя дифференцировке и созреванию В-клеток, а также выработке антител. VEGFA - мощный фактор роста эндотелия сосудов, который может вмешиваться в ангиогенез и играть ключевую роль в заживлении язв. После заражения Hp эти ключевые гены взаимодействуют с организмом и при посредничестве таких путей, как сигнальный каскад NF - κ B, образуют сложную сеть регуляции иммунного воспаления. Таким образом, препарат Huangqin Huanglian может оказывать терапевтический эффект на PU, связанные с Hp, благодаря прямому или косвенному действию нескольких активных ингредиентов.

МикроРНК - это тип одноцепочечной некодирующей малой РНК длиной примерно 18-25 нуклеотидов. Она связывается с 3′ или 5′ UTR-областью мРНК определенных целевых генов по принципу комплементарной пары оснований, играя роль в ингибировании трансляции или прямой деградации мРНК. Целью данного исследования является изучение влияния микроРНК на регуляцию экспрессии генов в основных генах препарата Хуанцинь Хуанлянь при лечении ГП. Наиболее функциональные микроРНК были найдены и проверены с помощью баз данных Target Scan и StarBase. В результате были обнаружены miR-93-5p, miR-374b-5p, miR-3937, miR-19a-3p, miR-4458, miR-590-5p, miR-6838-5p и miR-424-5p. Обнаружение этих микроРНК позволило прояснить молекулярный механизм действия препарата Хуанцинь Хуанлянь в лечении ГП на уровне некодирующих РНК.

Подводя итог, можно сказать, что на основе сетевой фармакологии и биоинформатики в данном исследовании был изучен основной механизм молекулярно-сетевой регуляции Scutellaria baicalensis Georgi и Coptis chinensis при лечении Hp, связанных с PU, уточнены основные гены и ключевые микроРНК, регулируемые Scutellaria baicalensis Georgi и Coptis chinensis при лечении Hp, связанных с PU, и проверены характеристики синергетического эффекта Scutellaria baicalensis Georgi и Coptis chinensis на многокомпонентном, многоцелевом и многоканальном уровне. Результаты исследования данной статьи согласуются с существующими исследованиями патогенеза и фармакологических эффектов Hp, связанных с ПУ, что в определенной степени подтверждает достоверность данной статьи. Результаты исследования данной статьи могут послужить научной основой для клинического продвижения и применения препарата Хуанцинь Хуанлянь в лечении ГП, а также дать идеи и рекомендации для будущих углубленных экспериментальных исследований.