Изучение механизма старения сушеной кожуры мандарина на основе технологии направленной метаболомики и технологии высокопроизводительного секвенирования
Ченпи - это высушенная и зрелая кожура плодов Citrus reticulata Blanco и его культурных сортов из семейства рутовых (Rutaceae). Он обладает свойствами регулировать ци и укреплять селезенку, высушивать сырость и рассасывать флегму, и является типичным представителем старой традиционной китайской медицины. Название "Чэньпи" впервые появилось в "Материале диетической терапии", а в литературе отмечается, что время старения варьируется. В "Lei Gong Pao Zhi Lun" говорится следующее: "Самое старое - самое прекрасное"; в "Ежедневной медицинской практике" говорится, что "выдержанная кожура мандарина еще лучше". В книге "Объяснение лекарственных свойств жгучей пушки Лэй Гуна" говорится следующее: "Если собрать и выдержать долгое время, то за лето пройдет много цветков сливы, и сильная ци будет полностью устранена, температура будет умеренной без риска сухости и рассеивания, а ци будет течь без опасности резкого пореза"; в "Лекарственном зеркале" записано: "Чэньпи следует выдерживать каждый второй год"; "Итан саньши" гласит: "Новая апельсиновая корка обладает сильной аурой и требует длительного производства. Требуется два-три года, чтобы она стала считаться превосходной".
Старение традиционной китайской медицины - это превращение китайской медицины из нового препарата в старое лекарство после соответствующих методов хранения, что приводит к изменению его свойств и эффективности, чтобы лучше удовлетворять клинические потребности традиционной китайской медицины. На протяжении всей истории человечества велись дискуссии о старении традиционной китайской медицины. В "Шэньнун бэнькао цзин" говорится, что "есть истинные и ложные лекарства, а также новые и старые лекарства, и у каждого из них свой метод", что указывает на то, что "новое" и "старое" имеют свои особенности и правила действия. В этом "Цзине" говорится об апельсиновой корке, но не упоминается о том, подвергалась ли она старению. В "Аннотациях к классической медицине Шэньнуна" впервые предложено шесть основных выдержанных лекарств: "Любые волчьи ягоды, цитрусовые, апельсиновые корки, пинеллия терната, эфедра и вучжуй, требующие длительного старения, хороши". В последующих поколениях медики продолжали расширять сферу применения традиционной китайской медицины. В "Компендиуме лекарственных средств" говорится следующее: "Ревень, лесные воры, кошачья мята, цветы кориандра, цветы саранки и т.д. также подходят для длительного старения, а не только для шести типов"; До династии Цин в книге "Бэнькао конгсин" говорилось: "Лучше всего использовать выдержанные травы, чтобы либо уменьшить их силу, либо удалить их огненную энергию". В ней содержится около 40 ароматов выдержанных трав. В настоящее время традиционная китайская медицина также подчеркивает, что некоторые китайские лекарства должны быть выдержаны для оптимального использования. Как видно, старение традиционной китайской медицины основано на обобщении клинической практики. Однако в литературных источниках нет глубокого объяснения механизма старения.

Существует множество исследований механизма старения традиционной китайской медицины, таких как Wu Zhu Yu, Qi Ai Ye, Ma Huang, Chen Pi и т.д., в основном сосредоточенных на сравнении химического состава и фармакологических эффектов при различных сроках старения. Качество исследований не является глубоким, а выводы противоречивы. Исследовательская группа использовала идею старения и микроорганизмов, связанных с качеством, в табаке дымового отверждения, чае и байцзюй для сравнения. Предыдущее исследование показало, что рост и метаболизм микроорганизмов, прикрепленных к кожуре мандарина в процессе старения, тесно связаны с изменением содержания флавоноидов и других активных ингредиентов. Считалось, что метаболизм Aspergillus niger, доминирующего микроорганизма, прикрепленного к кожуре мандарина, способствовал увеличению содержания флавоноидов. Лю изучил механизм микробного метаболизма и трансформации активных ингредиентов в выдержанной кожуре мандарина, и результаты показали, что микроорганизмы участвуют в процессе старения кожуры мандарина и могут трансформировать соединения в кожуре мандарина для увеличения содержания активных веществ. Кроме того, разнообразие бактерий и грибов на поверхности выдержанной мандариновой кожуры варьируется в зависимости от времени выдержки. Считается, что микроорганизмы в процессе старения мандариновой кожуры могут вызывать изменения в основе фармакологических веществ. Большое количество исследований подтвердило корреляцию между микроорганизмами и химическими компонентами в процессе старения кожуры мандарина, но нет отчета об общем анализе взаимодействия между прикрепленными микроорганизмами и вторичными метаболитами в кожуре мандарина на основе метаболомики и высокопроизводительного секвенирования. В данной статье впервые широко используется технология направленной метаболомики UPLC-ESI-MS/MS для анализа вторичных метаболитов кожуры выдержанных мандаринов после 1 года и 3 лет хранения, всесторонне выявляя вторичные метаболиты, общие метаболиты и дифференциальные метаболиты в образцах сравнительной группы; На основе технологии высокопроизводительного секвенирования всесторонне выявлена структура сообщества и изменения прикрепленных микроорганизмов в группе сравнения образцов, проведен скрининг дифференциальных микроорганизмов; Проведен корреляционный анализ между дифференциальными метаболитами, выявленными методом метаболомики, и дифференциальными микроорганизмами, идентифицированными методом высокопроизводительного секвенирования. Результаты исследования создают теоретическую основу для углубленного изучения механизма старения мандариновой кожуры.

Сбор образцов. Экспериментальные образцы, используемые в данном эксперименте, представляют собой мандариновую кожуру стандартного хранения одного происхождения, одной партии и разных лет хранения. Стандартное хранение - это хранение на месте происхождения, с регулярным сезонным контролем и регистрацией изменений температуры и влажности. Это хороший метод для отслеживания и сбора образцов, который позволяет избежать влияния неточных условий и года.

Анализ вторичных метаболитов. Технология метаболомики позволяет всесторонне и научно анализировать общий химический состав традиционной китайской медицины и широко используется для оценки качества таких сортов китайской медицины, как женьшень, Scutellaria baicalensis, Angelica dahurica, Paeonia lactiflora и Paeonia lactiflora. В данной статье используются обширные методы направленной метаболомики для всестороннего обнаружения вторичных метаболитов в кожуре выдержанных мандаринов после 1 года и 3 лет хранения. Анализ PCA, анализ OPLS-DA и анализ тепловых карт позволяют четко различать образцы разных лет. Интегрируя время удерживания соединений и характерные ионы (Q1 и Q3), из базы данных было извлечено 386 вторичных метаболитов, включая 79 фенольных кислот, 143 флавоноида, 4 антрахинона, 17 лигнанов и кумаринов, 3 дубильных вещества, 47 алкалоидов, 6 терпенов и 87 других классов. По сравнению с традиционными методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), этот метод имеет преимущество в идентификации большого количества соединений и может отражать общий спектр вторичных метаболитов в высушенной кожуре мандарина. Для обеспечения точности относительного содержания каждого соединения в данном эксперименте были получены данные масс-спектрометрического анализа метаболитов из разных образцов, интегрированы площади пиков всех веществ, а также интегрированы и скорректированы масс-спектрометрические пики одного и того же метаболита в разных образцах. Этот эксперимент относится к методам дизайна клинических и фармакологических экспериментов. В качестве контрольной группы использовали один год хранения высушенной кожуры мандарина, а в качестве экспериментальной - три года хранения образцов высушенной кожуры мандарина. Отбирали дифференциальные метаболиты с изменением кратности ≥ 2 или с изменением кратности ≤ 0,5 и VIP ≥ 1. Если разница в метаболитах между группами была более чем в 2 раза или менее чем в 0,5 раза и VIP ≥ 1, разница считалась значимой. В результате было отобрано 79 дифференциальных метаболитов, среди которых соединения с повышенным уровнем регуляции и высоким относительным содержанием могут рассматриваться как метаболиты, связанные с качеством сушеной кожуры мандарина. Среди 20 соединений с дифференциальными изменениями во вторичных метаболитах кожуры выдержанных мандаринов после 1 года и 3 лет выдержки, к числу соединений с повышенным содержанием относятся: 3,5-дигидрокси-3-метилвалериановая кислота, 5,7-дигидрокси-1 (3H)-изобензофуран-он, синапин, п-гидроксибензоил винная кислота, 3', 4', 7-тригидроксифлавон, катехин, лимонин, дигидробайбеев алкалоид B, кверцетин-О-рутинозин-гексоза и С-гексозил-ауреозин-О-синапирилгексоза. Среди них катехин, лимонин, 3', 4', 7-тригидроксифлавон обладают антибактериальным, противовоспалительным, антиоксидантным, противораковым и другими эффектами, и все они могут быть использованы в качестве потенциальных оценок качества. Исконные соединения. Лечение заболеваний с помощью традиционной китайской медицины характеризуется наличием множества компонентов, мишеней и путей. Как отобрать целевые компоненты для лечения заболеваний среди многочисленных компонентов - это ключ к оценке качества и контролю качества традиционной китайской медицины. Среди них широко используются такие методы, как прогнозирование данных о соединениях малых молекул, лекарственная химия сыворотки и метаболомика растений. Результаты этого эксперимента показывают, что при условии разумной группировки использование технологии широкой направленной метаболомики UPLC-ESI-MS/MS позволяет эффективно проводить скрининг метаболитов, связанных с качеством сушеной кожуры мандарина. Однако активность отобранных соединений еще нуждается в дальнейшей проверке путем сочетания с традиционными функциями сушеной мандариновой кожуры.
Механизм старения мандариновой кожуры. Традиционно считается, что выдержанная мандариновая кожура полезна. Однако широко известно, что в процессе старения мандариновой кожуры метаболические преобразования микроорганизмов влияют на химические компоненты кожуры, способствуя накоплению активных ингредиентов и достижению цели получения хорошей выдержанной мандариновой кожуры. Этот результат согласуется с данными об увеличении общего содержания флавоноидов в выдержанной кожуре мандарина. В данной статье проведен корреляционный анализ между дифференциальными метаболитами, обнаруженными с помощью метаболомики, и дифференциальными микроорганизмами, идентифицированными с помощью высокопроизводительного секвенирования. Результаты также подтверждают, что доминирующие бактериальные роды, такие как Aspergillus, Penicillium и Penicillium, могут существенно влиять на содержание активных ингредиентов в высушенной кожуре мандарина, что согласуется с литературными данными. Предварительное исследование исследовательской группы показало, что в процессе старения высушенной кожуры мандарина доминирующие группы микроорганизмов, прикрепленные к поверхности, постоянно эволюционируют. С увеличением времени старения доминирующие микроорганизмы переходят от Zasmidium, Cladosporium, Symmetrospora и Fusarium к Cladosporium, Aureobasidium, Aspergillus и Xeromyces. Xeromyces bisporus - микроорганизм, различающийся между образцами, хранившимися 1 год и 3 года, - является видом, более устойчивым к сухой плесени. Микроорганизмы, способные выживать в условиях низкой активности воды, могут адаптироваться к среде обитания с крайне низкой активностью воды (0,61), что соответствует крайне сухому состоянию выдержанной мандариновой кожуры. В то же время результаты эксперимента показали, что дифференцированные микроорганизмы, такие как Fusarium, Aspergillus и Fusarium, могут одновременно влиять на относительное содержание различных активных ингредиентов и компонентов аромата, таких как гесперидин, ванильная кислота, пуэрарин и кислотные компоненты. Таким образом, всестороннее суждение показывает, что дифференциальные микроорганизмы в образцах сушеной кожуры мандарина могут способствовать относительному увеличению активных ингредиентов, таких как гесперидин и другие флавоноиды, а также изменять относительное увеличение или уменьшение ароматических компонентов для регулирования запаха сушеной кожуры мандарина. Таким образом, научный смысл выражения "выдержанная кожура мандарина хороша" может быть тесно связан с влиянием дифференциальных микроорганизмов на относительное содержание вторичных метаболитов.