Ацетил хабазид индуцирует апоптоз в клетках рака толстой кишки HCT116 через сигнальный путь Wnt
Рак толстой кишки - четвертый по смертности вид рака в мире и распространенная злокачественная опухоль пищеварительной системы. Факторами риска развития рака толстой кишки являются генетика, ожирение, недостаток физической активности и курение. В настоящее время в клинической практике при раке толстой кишки в основном применяется хирургическое лечение. Из-за сложности выявления рака толстой кишки на ранних стадиях лучшие возможности для хирургического вмешательства при постановке диагноза оказываются упущенными. В это время пациентам часто требуется лучевая и химиотерапия для улучшения прогноза. Однако традиционные химиотерапевтические препараты имеют больше побочных реакций, в то время как натуральные препараты имеют меньше побочных реакций и более доступны по цене.

Ajuga ciliata Bunge - многолетнее травянистое растение семейства Lamiaceae, распространенное в основном в Хэбэе, Шаньдуне, Шэньси, Ганьсу, Сычуани и других регионах Китая. Все растение Gynostemma pentaphyllum может использоваться в качестве лекарственного средства и широко применяется в китайской народной медицине для лечения таких заболеваний, как легочное тепловое кровохарканье, травматические повреждения, тонзиллит, фарингит и др. Содержание 8-O-ацетилхарпагида (8-OA) в Gynostemma pentaphyllum является самым высоким. Согласно предыдущим исследованиям You et al., ацетил рамнозид обладает сильным противовоспалительным действием и может облегчить ранний воспалительный экссудат в капиллярах. Поскольку медиаторы воспаления сами по себе могут играть регуляторную роль в прогрессировании опухоли, ацетил рамнозид может оказывать противоопухолевое действие через воспалительный путь. Кроме того, Коношима и др. обнаружили, что ацетил рамнозид оказывает значительное ингибирующее действие на рак кожи у мышей, индуцированный оксидом азота, и может подавлять пролиферацию клеток рака печени, индуцированную N-нитрозодиэтиламином и фенобарбиталом, что указывает на то, что ацетил рамнозид может быть потенциальным противоопухолевым препаратом.

Цель данного исследования - изучить роль ацетилхабабина в противоопухолевом действии путем исследования ряда биологических изменений поведения после воздействия ацетилхабабина на клетки рака толстой кишки HCT116.

 

На долю рака толстой кишки ежегодно приходится около 10% смертей от рака во всем мире. В настоящее время основным методом лечения рака толстой кишки является хирургическое вмешательство, дополняемое химиотерапией и лучевой терапией. Эффективность химиотерапии для пациентов на поздних стадиях рака низкая, побочные эффекты значительны, а период выживания составляет всего около 18 месяцев. В последние годы поиск противоопухолевых препаратов в природных растениях стал одним из основных направлений исследований, поскольку некоторые традиционные химиотерапевтические препараты, включая паклитаксел и винкристин, получены из природных растений.

Борьба с пролиферацией является важной отправной точкой для разработки противораковых препаратов. Метод CCK8 показал, что ингибирующий эффект ацетил рамнозида на клетки HCT116 зависит от концентрации и времени, а значения IC50 составляют 0,91, 0,39 и 0,39 ммоль/л в трех временных точках, что указывает на то, что ацетил рамнозид оказывает свое действие в основном в течение первых 48 часов. Кроме того, в ходе экспериментов по клонированию пластин было продемонстрировано, что ацетил рамнозид может значительно снижать колониеобразующую способность клеток HCT116.

Способность опухолевых клеток к пролиферации и выживанию гораздо сильнее, чем у нормальных клеток, и большинство противораковых препаратов могут подавлять пролиферацию опухолевых клеток, вызывая остановку клеточного цикла и апоптоз. В процессе гибели клеток часто наблюдаются такие явления, как повышение уровня реактивных форм кислорода, активация цистеиновых протеаз и конденсация хроматина. Среди них - потеря трансмембранного потенциала митохондрий, вызывающая высвобождение цитохрома c из митохондрий в цитоплазму, что является ключевым этапом в индуцировании апоптоза. Bax и Bcl2 имеют решающее значение для высвобождения цитохрома c и активации последующих белков каспаз. С помощью проточной цитометрии мы обнаружили, что ацетил рамнозид может дозозависимо влиять на клеточный цикл клеток рака толстой кишки HCT116, вызывая остановку клеточного цикла в фазе G1 и значительно повышая уровень апоптоза клеток.

Исследования подтвердили, что сигнальный путь Wnt сильно коррелирует с развитием рака толстой кишки. Среди них β - катенин является ключевой молекулой в классическом пути Wnt, а комплекс E-cadherin/β - катенин помогает стабилизировать межклеточную адгезию, тем самым уменьшая инвазию и метастазирование клеток. В опухолевых клетках β - катенин может активировать транскрипцию генов, связанных с пролиферацией раковых клеток, циклом, апоптозом, миграцией, инвазией и лекарственной устойчивостью, что приводит к злокачественному разрастанию опухолей. Кроме того, доказано, что β-катенин является перспективной мишенью для профилактики и лечения рака. Многие натуральные продукты могут выступать в качестве ингибиторов β-катениновой сигнализации, в основном через фосфорилирование, убиквитинирование и ингибирование его ядерной транслокации. Ингибиторы натуральных продуктов показали хороший профилактический и терапевтический эффект в различных моделях опухолей in vitro и in vivo. β - катенин может способствовать экспрессии нижележащей молекулы Myc в ядре. Myc относится к семейству онкогенов и кодирует важнейшие ядерные факторы транскрипции в ядре, в основном участвующие в регуляции клеточного роста, пролиферации, дифференцировки, цикла, метаболизма, апоптоза и т.д. У млекопитающих семейство белков Myc включает три категории: c-Myc, n-Myc и l-Myc. c-Myc ассоциируется с нестабильностью генома и опухолевым генезом. В покоящихся клетках уровень экспрессии c-Myc низок, а как только клетка входит в клеточный цикл, экспрессия c-Myc быстро возрастает в несколько раз. Кроме того, значительное повышение уровня белка c-Myc было обнаружено примерно в 70% случаев рака толстой кишки, что указывает на положительную корреляцию между c-Myc и злокачественностью рака толстой кишки.

В этом эксперименте с помощью высокопроизводительного секвенирования транскриптома было выявлено 4129 дифференциально экспрессированных генов в клетках HCT116, индуцированных ацетил рамнозидом, включая 1921 ген с повышенной и 2208 генов с пониженной экспрессией. Дифференциально экспрессируемые гены в основном связаны с клеточным ростом, клеточным циклом, клеточной инвазией, клеточным иммунитетом, окислительным стрессом, клеточным метаболизмом, молекулярным транспортом и путями клеточной смерти. После анализа дифференциально экспрессированных генов в сочетании с базой данных KEGG было установлено, что ацетил рамнозид значительно влияет на сигнальный путь Wnt в клетках HCT116. Значительное снижение уровня β-катенина и c-Myc было подтверждено с помощью экспрессии генов и обнаружения белков при использовании ацетил рамнозида и контрольной группы. Комбинация ацетил рамнозида и ингибитора малых молекул Wnt XAV939 еще больше подавляла рост клеток рака толстой кишки HCT116, указывая на то, что путь Wnt/β - катенин также опосредует лекарственную устойчивость HCT116. Ингибирование пути Wnt/β - катенин может значительно усилить противоопухолевую активность ацетил рамнозида.

Данное исследование показало, что ацетил рамнозид может эффективно подавлять пролиферативную активность клеточной линии рака толстой кишки HCT116. Геномное тестирование выявило значительные различия в сигнальном пути Wnt/β - катенин в клетках, что позволяет предположить, что ацетил рамнозид может подавлять рост нормальных клеток путем регулирования сигнального пути Wnt/β - катенин, далее вызывая апоптоз и остановку цикла клеток, тем самым подавляя рост опухолевых клеток. Однако это предположение требует дополнительных доказательств, а его конкретный механизм действия - дальнейшего углубленного изучения.