Исследование защитного эффекта суммарных флавоноидов из Platycodon grandiflorus на острое повреждение печени крыс на основе сигнального пути SIRT6/NF - κ B
Острое повреждение печени (ОПП) - это заболевание, характеризующееся внезапным нарушением функции печени, вызванным различными причинами в короткий срок. Оно является начальной стадией многих заболеваний печени, а его патогенез сложен; острое повреждение печени, вызванное отравлением лекарственными препаратами, иммунным ответом, вирусной инфекцией, ишемией-реперфузией и т. д., тесно связано с окислительными свободными радикалами, факторами воспаления и апоптозом клеток. Исходя из современного состояния исследований в области лечения острого повреждения печени как в стране, так и за рубежом, западная медицина часто диагностирует заболевания печени по клиническим проявлениям и патологическим изменениям. Однако до сих пор существует определенное отклонение от клинической практики, и в клинической практике все еще не хватает эффективных многоцелевых гепатопротекторных препаратов для лечения повреждений печени, вызванных различными причинами. Благодаря постоянному углублению фундаментальной теории традиционной китайской медицины и клинических исследований заболеваний печени, она постепенно демонстрирует преимущества в профилактике и лечении заболеваний печени. Исследование острого повреждения печени в теории традиционной китайской медицины показало, что его патогенез в основном связан с неспособностью положительного дефицита противостоять внешним патогенам, что приводит к попаданию влажного тепла и токсичных патогенов в кровоток, застою крови, депрессии печени и застою ци. Поэтому поиск препаратов для лечения острого повреждения печени и изучение механизмов их действия имеют большое значение.

Воспалительный ответ получил широкое внимание в лечении острого повреждения печени и других заболеваний, среди которых ядерный фактор транскрипции - κ B (NF - κ B) является важным воспалительным транскрипционным фактором. Когда печень подвергается воспалительному ответу, он стимулирует ацетилирование NF - κ B, инициирует транскрипцию нижележащих факторов воспаления, таких как TNF - α, IL-1 β, IL-6, и связывается с промоторными областями генов VCAM-1 и MCP-1 для регуляции, увеличивая высвобождение факторов воспаления и синтез медиаторов воспаления. Silencing information regulatory factor 2 (SIR2) - широко распространенная в живых организмах никотинамид-аденин-динуклеотид (NAD+) - зависимая деацетилаза. У человека существует семь белков, гомологичных SIRT2: SIRT1~SIRT7. SIRT6 расположен на 13,3 конце хромосомы 19 и кодирует белки длиной 355 и 328 аминокислот 8 и 7 экзонами соответственно. Он оказывает ингибирующее действие на транскрипцию генов путем деацетилирования и модификации участка H3K9 многих геномных белков, включая NF - κ B, на хроматине, тем самым снижая экспрессию факторов воспаления и оказывая противовоспалительное действие.

Polygonum perfoliatum L., растение семейства Polygonaceae и рода Polygonum, представляет собой цельное растение, используемое для лечения желтухи, отечного нефрита, мастита, коклюша, хронической экземы, укусов ядовитых змей и сырой тепловой желтухи. Он обладает антибактериальным, противовирусным, антимутагенным, понижающим кровяное давление, противоопухолевым и кровоостанавливающим действием. Представители народности Гуанси-Чжуан широко используют его для профилактики и лечения заболеваний печени. В последние годы наша исследовательская группа проводила систематические фармакологические, патологические и химические исследования по извлечению, разделению и определению содержания активного компонента - общих флавоноидов, которые обладают гепатопротекторными и противоповреждающими свойствами, чтобы определить основу фармакологического вещества для профилактики и лечения заболеваний печени с помощью лекарственной травы "Гангбанги". Эксперименты показали, что ТФП может снижать активность аланиновой аминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ), повышать активность антиоксидантных ферментов, таких как общая супероксиддисмутаза (T-SOD) и глутатионпероксидаза (GSH Px), а механизм его действия может быть связан с антиоксидантной активностью свободных радикалов, ингибированием перекисного окисления липидов, укреплением иммунитета и снижением уровня воспалительных медиаторов.

Цель данного эксперимента - изучить защитное действие ТФП на острое повреждение печени, вызванное четыреххлористым углеродом (CCl4) у крыс, исходя из вышеуказанного патогенеза и характеристик, а также исследовать механизм гепатопротекции с точки зрения окислительного стресса и воспаления, обеспечивая экспериментальную основу для разработки и применения ТФП.

Семьдесят самок крыс SD были случайным образом разделены на семь групп в зависимости от массы тела: нормальная группа, контрольная группа ТФП (200 мг/кг), модельная группа CCl4, группа CCl4+силимарин (120 мг/кг) и группы CCl4+ТФП в высоких, средних и низких дозах (200, 100, 50 мг/кг), по 10 крыс в каждой группе. Нормальная группа и группа моделирования CCl4 получали дистиллированную воду (8 мл/кг) через желудок, а остальные группы получали соответствующие дозы препарата через желудок один раз в день в течение 10 дней подряд. После последнего введения, за исключением нормальной группы и группы контроля ТФП, всем остальным группам внутрибрюшинно вводили раствор оливкового масла 12% CCl4 (5 мл/кг) для создания модели острого повреждения печени. В течение 16 часов проводили голодание без воды и забор ткани печени после взятия крови из глазного яблока. Биохимические методы использовались для определения показателей функции печени и окислительного стресса в сыворотке крови; иммуноферментный анализ (ELISA) использовался для определения уровня воспалительных факторов в ткани печени; Вестерн-блот использовался для определения уровня экспрессии белков, связанных с SIRT6/NF - κ B путем, в ткани печени; HE окрашивание использовалось для изучения степени поражения ткани печени, а иммуногистохимия использовалась для наблюдения за уровнем экспрессии p-NF - κ B p65 в ткани печени.

В данном эксперименте была создана крысиная модель острого повреждения печени, вызванного CCl4, и проведено вмешательство с использованием общих флавоноидов (ОФП) из Scutellaria baicalensis. По показателям функции печени, патологическим срезам и экспрессии соответствующих факторов воспаления было установлено, что ТФП оказывают смягчающее действие на острое повреждение печени у крыс. В научных исследованиях создание успешной животной модели повреждения печени является одним из ключевых шагов в скрининге гепатопротекторных препаратов. CCl4 в основном индуцирует метаболизм свободных радикалов, что приводит к окислительному стрессу, разрушающему структуру клеточных мембран печени, увеличивающему проницаемость клеточных мембран и вызывающему воспалительную инфильтрацию нейтрофилов. Уровень АЛТ, АСТ, ЩФ, ТБИЛ и γ-глутамилтранспептидазы (γ-ГТ) в цитоплазме повышается, а продукция перекиси липидов - малонового диальдегида (МДА) - продолжает повреждать структуру клеточной мембраны, создавая порочный круг. Кроме того, CCl4 может вызывать снижение активности антиоксидантных ферментов - общей супероксиддисмутазы (T-SOD) и глутатионпероксидазы (GSH Px), приводя к дисбалансу ферментной антиоксидантной системы, что может формировать порочный круг окислительного стресса и усугублять воспалительные реакции. Поэтому повышение соответствующих показателей, таких как АЛТ, АСТ, ЩФ, ТБИЛ, γ - ГТ, содержание МДА, а также снижение активности Т-СОД и GSH Px можно рассматривать как важные критерии для определения тяжести острого повреждения печени. В данном эксперименте после моделирования CCl4 по сравнению с нормальной группой у крыс модельной группы значительно повышались уровни АЛТ, АСТ, АЛП, ТБИЛ, γ - ГТ и МДА в сыворотке крови, а активность T-SOD и GSH Px значительно снижалась. Патологические срезы, окрашенные по методу HE, показали серьезное повреждение структуры печеночной ткани, клетки печени демонстрировали сильную вакуольную деформацию и были инфильтрированы большим количеством воспалительных клеток. Дольковая структура печени была сильно повреждена, что свидетельствует об успешном создании модели острого повреждения печени.

По имеющимся данным, SIRT6 регулирует экспрессию теломерного хроматина и нижележащих генов в сигнальном пути NF - κ B. Транскрипционный фактор NF - κ B играет ключевую роль в ответе на стресс окружающей среды, регулируя гены, связанные с пролиферацией, апоптозом, дифференцировкой, воспалением и регуляцией иммунной системы. В нестрессовых условиях NF - κ B изолируется в цитоплазме своим ингибитором I κ B α. В условиях стресса I κ B α деградирует, позволяя факторам транскрипции NF - κ B мигрировать в ядро и активировать транскрипцию ключевых генов. Учитывая важность и тканевую специфичность этих генов-мишеней, активация NF- κ B-пути строго регулируется несколькими механизмами, один из которых включает NAD+-зависимую деацетилазу и АДФ-рибозилтрансферазу SIRT6. После активации пути SIRT6 связывается с промоторной областью гена-мишени NF - κ B, способствуя глушению гена путем деацетилирования лизина 9 гистона H3. TNF - α, секретируемый мононуклеарными макрофагами, способствует развитию воспалительной реакции и активации макрофагов, контролируя выработку и секрецию медиаторов воспаления. IL-1 β в основном секретируется мононуклеарными макрофагами и лимфоцитами. Помимо запуска патогенных воспалительных реакций, он также способствует экспрессии различных факторов воспаления и участвует в острофазных воспалительных реакциях. ИЛ-6 - фактор воспаления, секретируемый мононуклеарными макрофагами и обладающий различной биологической активностью. При повреждении печени мононуклеарные макрофаги выделяют избыточное количество ИЛ-6, что приводит к массивному некрозу клеток печени и в конечном итоге может перерасти в фиброз или даже цирроз печени. В то же время большое количество агрегатов IL-6 ускоряет контакт между лейкоцитами и эндотелиальными клетками через VCAM-1, и большее количество моноцитов достигает поврежденного участка печени через MCP-1, усугубляя воспалительную реакцию.

Современные исследования показали, что Кангбан Гуй обладает богатым фармакологическим действием, таким как облегчение кашля и мокроты, антиоксидантное и противовоспалительное, а также противовирусное. Результаты эксперимента показали, что он также широко используется в клинической практике для лечения различных заболеваний, таких как ожоги, кашель, опоясывающий герпес, острый нефрит и бактериальная дизентерия, причем все они обладают хорошим терапевтическим эффектом. В то же время Кангбан Гуй также был разработан в различных лекарственных формах и широко используется в клинической практике. В данном эксперименте были протестированы различные показатели, обычно используемые в клинической практике для определения функции печени. Результаты показали, что после введения ТФП, по сравнению с обычной группой, основные показатели трансаминаз и функции печени в сыворотке крови крыс контрольной группы ТФП не имели статистически значимого влияния, что указывает на отсутствие негативного влияния ТФП на функцию печени; по сравнению с модельной группой, уровень трансаминаз в сыворотке крови крыс в каждой дозовой группе CCl4+ТФП снизился, а уровень антиоксидантных факторов увеличился, что указывает на эффективное улучшение показателей функции печени и усиление антиоксидантной способности организма с помощью ТФП. Ожидается, что он будет разработан в качестве эффективного и низкотоксичного гепатопротекторного препарата. Микроскопическое наблюдение показало, что после лечения структура печеночной ткани, размер вакуолей и степень деформации у крыс значительно улучшились по сравнению с модельной группой. Воспалительная клеточная инфильтрация значительно уменьшилась, а экспрессия p-NF - κ B p65 ослабла. Для определения экспрессии белков SIRT6, p-NF - κ B p65, MCP-1 и VCAM-1 использовали вестерн-блот. Результаты показали, что экспрессия SIRT6 увеличилась, а экспрессия p-NF - κ B p65 уменьшилась в каждой группе доз ТФП. Экспрессия ключевых провоспалительных факторов MCP-1, VCAM-1, TNF - α, IL-6 и IL-1 β снизилась, что говорит о том, что ТФП может эффективно улучшать острое повреждение печени у крыс за счет снижения воспаления печени и усиления антиоксидантной способности. Этот результат позволяет предположить, что ТФП может оказывать противоострое повреждение печени путем стимулирования экспрессии SIRT6 и ингибирования транскрипции NF - κ B для снижения высвобождения нижележащих факторов воспаления.

Таким образом, ТФП может эффективно облегчить повреждение печени, а механизм его действия может быть связан с воспалительным ответом и антиоксидантной реакцией, опосредованной SIRT6/NF - κ B-путем. Результаты исследования, проведенного в этой статье, могут дать новые методы и стратегии для клинического применения ТФП для облегчения повреждения печени.