Одновременное определение шести флавоноидов в листьях вуйяо методом сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией
Lindera aggregata (Sims) Kosterm, растение из семейства камфорных и рода Piper, обладает противовоспалительным, обезболивающим, антиоксидантным и противоопухолевым действием. Производится в основном в юго-восточных прибрежных провинциях Китая, наиболее известен в уезде Тяньтай провинции Чжэцзян, поэтому его называют Тяньтай Вуяо. В 2018 году он был выбран в качестве одного из новых "Восьми ароматов Чжэцзяна" в Чжэцзяне. Современные фармакологические исследования показали, что черное лекарство также оказывает иммуномодулирующее воздействие на центральную нервную и сердечно-сосудистую системы, что делает его рыночные перспективы широкими. Однако лекарственные части вуяо растут медленно, и зачастую требуется 8-10 лет, чтобы они соответствовали требованиям, предъявляемым к качеству переработки лекарственных растений. В процессе роста части стебля и листьев часто выбрасываются, что приводит к низкому уровню использования ресурсов. В народных районах Чжэцзяна листья уйяо часто используются для лечения острого целлюлита, ревматоидного артрита и других воспалений, а также из них часто готовят чайные напитки для снижения уровня липидов, защиты печени и других полезных свойств. Предыдущие исследования показали, что экстракты листьев вуйяо обладают определенным липидоснижающим эффектом. Исследовательская группа провела исследование фармакологической корреляции экстрактов листьев уйяо и обнаружила, что они обладают определенным механизмом действия против гиперлипидемии и остеопороза. В то же время на начальном этапе было проведено систематическое разделение химических компонентов и экстракция листьев Wuyao. Из этанольного экстракта листьев вуйяо впервые были выделены шесть флавоноидов, которые были идентифицированы как: каэмпферол-3-О - α - L-рамнозид (1), кверцетин (2), каэмпферол-3-О - β - D-ксилозид (3), каэмпферол-3-О - α - L-арабинофуранозид (4), каэмпферол-3-О - (2 ″ -3-O-транс-3-O-p-3-O-кумароил) - α - L-рамнозид (5), каэмпферол-3-О - (2 ″, 4 ″ -3-О-ди-3-О-3-3-О-ди-3-глюкозид) О-транс-3-О-п-3-О-кумароил) - α - L-рамнозид (6), химическая структура представлена на рисунке 1.

В настоящее время существуют соответствующие исследовательские отчеты по оценке качества листьев вуйяо. И и др. использовали ВЭЖХ для определения содержания четырех флавоноидов в листьях вуйяо различного происхождения из провинции Хунань. Сунь и др. использовали УФ-спектрофотометрию для определения общего содержания флавоноидов в экстрактах листьев вуяо и исследовали соответствующие факторы для извлечения общих флавоноидов, чтобы оптимизировать процесс экстракции. В то же время Sun et al. использовали ВЭЖХ для определения содержания четырех сесквитерпеноидных лактонов в листьях Wuyao различного происхождения. Однако это традиционные методы обнаружения, которым не хватает высокой эффективности и точности в определении содержания. С развитием технологии масс-спектрометрии была разработана технология сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии, обладающая высокой эффективностью, высокой специфичностью и высокой чувствительностью. Хроматографическая тандемная масс-спектрометрия (UPLC-MS/MS) стала важным аналитическим методом для определения качества традиционных китайских лекарственных материалов. Поэтому в данном исследовании мы используем технологию UPLC-MS/MS для количественного изучения шести основных флавоноидов в листьях Wuyao различного происхождения, а также для анализа и оценки методом энтропийного веса - α - L-аппроксимативного ранжирования идеальных решений (TOPSIS), чтобы обеспечить научную основу для внутреннего контроля качества листьев Wuyao.

 

Выбор условий экстракции. В данном исследовании метод UPLC-MS/MS был использован для одновременного определения содержания шести индикаторных соединений, а именно: каэмпферол-3-О - α - L-рамнозид (1), кверцетин (2), каэмпферол-3-О - β - D-ксилозид (3), каэмпферол-3-О - α - L-арабинофуранозид (4), каэмпферол-3-О - (2"- транс - п-кумароил) - α - L-рамнозид (5) и каэмпферол-3-О - (2", 4"- ди транс - п-кумароил) - α - L-рамнозид (6), в листьях Wuyao в течение 10 минут. Концентрация метанола составляла 30%, 50% и 70%, соответственно. На основе анализа спектра был выбран метанол 70%, обеспечивающий наилучший эффект экстракции. В то же время было проведено сравнение между методами экстракции при нагревании под рефлюксом и ультразвуком. Судя по результатам, полученные скорости экстракции были сопоставимы. Учитывая затраты времени и расходных материалов, была выбрана ультразвуковая экстракция.
Условия хромато-масс-спектрометрии. В данном исследовании изучались три системы подвижных фаз: вода с ацетонитрилом, вода с ацетонитрилом-0,1% муравьиной кислоты и вода с ацетонитрилом-0,1% формиата аммония. Площадь пика и форма пика шести флавоноидов использовались в качестве оценочных показателей для определения подходящей системы подвижной фазы. Было обнаружено, что при выборе ацетонитрила в качестве подвижной фазы наблюдается явление хвостообразования в соединениях каэмпферола-3-О - (2"-транс-кумароил) - α - L-рамнозида и каэмпферола-3-О - (2", 4"-ди-транс-кумароил) - α - L-рамнозида; при выборе ацетонитрила 0.Когда в качестве подвижной фазы выбран ацетонитрил 0,1% вода с формиатом аммония, кверцетин 3-O - α - L-арабинофуранозид демонстрирует незначительный хвост; Когда в качестве подвижной фазы выбран ацетонитрил 0,1% вода с муравьиной кислотой, формы пиков всех шести соединений были относительно симметричными. Поэтому в качестве системы подвижной фазы был выбран ацетонитрил 0,1% муравьиная кислота вода. При выборе условий масс-спектрометрии для определения содержания шести целевых соединений использовали режимы положительных и отрицательных ионов. Для обеспечения лучшей стабильности целевых соединений, более высоких значений отклика и лучших форм пиков, многократные повторные эксперименты показали, что использование режима сканирования отрицательных ионов для определения позволяет сделать шесть флавоноидных соединений более стабильными, с лучшими формами пиков и значениями отклика в условиях определения. В то же время, при исследовании условий хромато-масс-спектрометрии, времена удерживания флавоноидов 2 и 5, выделенных из ионной хроматограммы на рисунке 2, были практически одинаковыми. По сравнению с традиционными методами ВЭЖХ-анализа, хромато-масс-спектрометрия, основанная на анализе отношения массы к заряду, не зависит от разделения пиков, имеет короткое время сбора сигнала и высокую чувствительность. Поэтому в данном исследовании для одновременного определения шести флавоноидов в листьях вуяо была использована технология анализа UPLC-MS/MS, которая имеет больше преимуществ.
Анализ результатов. В данном исследовании были собраны образцы лекарственного сырья из 10 районов производства вуйяо в Китае, и с помощью технологии UPLC-MS/MS было проведено одновременное определение содержания шести химических компонентов в листьях вуйяо. Для комплексного анализа и оценки шести соединений из 10 районов производства был использован метод энтропийного взвешивания TOPSIS. Комплексное ранжирование было следующим: Тяньтай, Чжэцзян>Цзиньхуа, Чжэцзян>Чанша, Хунань>Ниндэ, Фуцзянь>Кунмин, Юньнань>Тунлу, Чжэцзян>Гуйлинь, Гуанси>Интан, Цзянси. Результаты показали, что комплексное качество листьев вуйяо в Тяньтай, Чжэцзян, было относительно высоким, что связано с традиционным мнением о том, что Тяньтай, Чжэцзян, является подлинным районом производства лекарственного сырья вуйяо. В то же время, это подтверждает запись в "Компендиуме медицинских материалов" о том, что в производстве вуйяо побеждает Тяньтай; в "Словаре традиционной китайской медицины" говорится, что производство вуйяо является крупнейшим в Чжэцзяне, а качество продукции, произведенной в Тяньтае, Чжэцзян, является наилучшим, поэтому она называется "Тяньтай вуйяо" или "Тай вуйяо". В то же время результаты оценки показывают, что существуют значительные различия в содержании шести основных флавоноидов в листьях вуяо разного происхождения, а также значительные различия в листьях вуяо из разных городов одной провинции. Это может быть связано с источниками интродукции вуйяо на разных посадочных базах и в разных экологических условиях.
В настоящее время Wuyao Ye был одобрен как новый ресурсный продукт питания, поэтому его разработка будет продолжена. В данном исследовании был разработан метод, который прост в эксплуатации, обладает хорошей точностью, стабильностью и воспроизводимостью и позволяет одновременно определять содержание шести флавоноидов в Wuyao Ye. Он может быть использован для количественного анализа и комплексной оценки основных флавоноидов в Wuyao Ye, а используемый метод энтропийного взвешивания TOPSIS также обеспечивает теоретическую основу для оценки качества других лекарственных трав с лекарственной ценностью.