A Panax ginseng és a Panax ginseng szaponinok immunmoduláló hatásának vizsgálata a RAW 264.7 sejteken in vitro
A szervezet nem specifikus immunitásában részt vevő makrofágok a kórokozókkal szembeni első védelmi vonal. Az aktivált makrofágok különböző gyulladásos faktorokat és citokineket (például NO és TNF - α) szabadíthatnak fel, hogy részt vegyenek a szervezet immunválaszában és szabályozzák az immunválaszt. A kutatások kimutatták, hogy a hagyományos kínai orvoslásban található szaponinok képesek aktiválni a makrofágokat, fokozzák a sejtek fagocitáló képességét, elősegítik a kapcsolódó aktív molekulák kiválasztását, és felszabályozzák a kapcsolódó fehérjék expresszióját. A Radix Pseudostellaria fibroblast gyökerek szaponinjai (RPFRS) a Pseudostellaria heterophylla ginzeng gyökeréből izolált bioaktív komponensek egyike, amelyek a szervezet immunitását fokozó, antioxidációs stb. hatással bírnak. Napjainkban a Panax ginseng fő gyökerét gyógyszerként használják, míg a gyökérselymet kidobják, ami nagy hulladékot okoz. A kutatások megállapították, hogy a Panax ginseng gyökérselyem átlagos összes szaponin tartalma 1,14-szerese a gyökérgumóénak. A kutatócsoport előzetes kutatásai kimutatták, hogy a Panax ginseng és a Panax ginseng főleg szaponinokból álló kivonata immunvédő hatással van immunszupprimált egerekre, és fokozza immunfunkciójukat. Jelenleg kevés beszámoló van csak az RPFRS immunhatásairól, és az egér mononukleáris makrofágokat (RAW 264.7 sejtek) gyakran használják modellként az in vitro immunaktivitási vizsgálatokhoz. Ezért ez a kísérlet a RAW 264.7 sejteket célozta meg, és az RPFRS immunmoduláló hatásait és lehetséges mechanizmusait vizsgálta in vitro olyan immunológiai mutatók kimutatásával, mint a sejtproliferáció, a fagocitikus aktivitás, a kapcsolódó citokinek és az mRNS-expresszió. A vizsgálat célja az RPFRS immunológiai tartalmának gazdagítása és elméleti alapot nyújt a Panax ginseng fejlesztéséhez és felhasználásához.

 

Az RPFRS hatása a RAW 264.7 sejtek proliferációjára. A szaponinok bizonyos hemolitikus és toxikus tulajdonságokkal rendelkeznek, és más növényi kivonatokhoz képest alacsonyabb toxikus dózisokkal rendelkeznek, ezért használatuk során figyelni kell az adagolásra. Annak megállapítására, hogy az RPFRS-nek van-e toxikus hatása a RAW 264.7 sejtekre, valamint a kísérletekhez szükséges optimális RPFRS-koncentráció szűrésére az MTT-módszert használtuk a különböző RPFRS-koncentrációk RAW 264.7 sejtek proliferációjára gyakorolt hatásának meghatározására. A kísérlet eredményei azt mutatták, hogy az RPFRS a 12,5-800 μ g/ml koncentrációtartományban (P<0,01) jelentősen elősegítheti a RAW 264,7 sejtek proliferációját, és a 12,5-100 μ g/ml koncentrációtartományban dózis-válasz összefüggést mutatott. Ezért a 12,5-200 μ g/ml koncentrációkat választottuk ki a további kísérletekhez.

Az RPFRS hatása a RAW 264.7 sejtek fagocitikus aktivitására. A fagocitózis a makrofágok egyik fő funkciója. A nem specifikus immunitásban a makrofágok a sejtekben lévő kórokozókat, a szervezet elhalt sejtjeit és más nagy részecskés antigéneket a fagocitózis révén képesek elpusztítani vagy megemészteni. A specifikus immunitásban szerepet játszhatnak az immunszabályozásban és az antigénprezentációban. Vannak kutatási jelentések arról, hogy mind a Platycodon grandiflorus D szaponinok, mind a Magnolia grandiflorus szaponinok képesek fokozni az egér makrofágok fagocitáló képességét. Összhangban a korábbi vizsgálatokkal, a kísérlet eredményei azt mutatják, hogy az RPFRS 12,5-200 μ g/mL koncentrációban (P<0,01) dózisfüggő módon növelheti a RAW 264.7 sejtek semleges vörös fagocitózisának OD-értékét (P<0,01), ami azt jelzi, hogy az RPFRS fokozhatja a RAW 264.7 sejtek fagocitikus aktivitását és fokozhatja immunfunkciójukat.

Az RPFRS hatása a NO szekréciójára és az iNOS mRNS expressziójára RAW 264.7 sejtekben. A makrofágok az immunrendszer gyulladásos válaszainak kiváltásával képesek eltávolítani a kórokozókat, és segítik a szervezetet a specifikus immunválaszok szabályozásában, míg a nitrogén-oxid-szintáz (iNOS) által szintetizált NO szorosan kapcsolódik a gyulladásos immunválasz funkciójához. Yang és munkatársai megállapították, hogy a Panax ginseng fehérjehidrolizátuma elősegítheti a RAW 264 sejtek NO-szekrécióját és a makrofágok TNF - α aktiválását, fokozva immunaktivitásukat. A kísérlet eredményei azt mutatták, hogy a vak kontrollcsoporthoz képest az RPFRS jelentősen növelni tudta a RAW 264.7 sejtek felülúszójának NO-tartalmát (P<0,05), és ezzel egyidejűleg az iNOS expressziója is jelentősen megnőtt a RAW 264.7 sejtekben (P<0,01), mindkettő dózisfüggő növekedést mutatott. Ez az eredmény összhangban van Li és munkatársai megállapításaival, miszerint az Asztragalozid IV képes növelni az NO és az iNOS mRNS expresszióját a RAW 264.7 sejtek felülúszójában.
Az RPFRS hatása a RAW 264.7 sejtek citokin-szekréciójára és mRNS-expressziójára. Az olyan citokinek, mint az IL-6, IL-10, IL-1 β és TNF - α elsősorban a helyi és szisztémás gyulladásos válaszokban játszanak szerepet. Az IL-6 indukálhatja a B-limfocita prekurzorokat, hogy ellenanyag-szekretáló sejtekké váljanak. Az IL-10, mint gyulladáscsökkentő faktor, gátolhatja a makrofágok aktivitását és az olyan gyulladásos citokinek, mint az IL-6 és a TNF - α. Az IL-1 β elősegítheti a makrofágok és neutrofilek aktiválódását és degranulációját, valamint más gyulladásos faktorok expresszióját. A TNF α a fő pro-inflammatorikus citokin, amelyet a makrofágok termelnek különböző ingerekre válaszul, és amely elősegítheti az olyan citokinek, mint az IL-6 és az IL-8 szekrécióját. Sun és munkatársai megállapították, hogy a szójabab szaponin Ab növelheti a TNF - α és az IL-1 β szintjét a RAW 264.7 sejtek felülúszójában. Li és munkatársai megállapították, hogy az asztragalozid IV növelheti az IL-6, IL-1 β és TNF - α szintjét és mRNS expresszióját a RAW 264.7 sejtek felülúszójában. A vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a vak kontrollcsoporthoz képest az RPFRS dózisfüggően növelni tudta az IL-6, IL-10, IL-1 β és TNF - α szintjét a RAW 264.7 sejtek felülúszójában. Az RPFRS különböző mértékben növelte az IL-6, IL-10, IL-1 β és TNF - α mRNS expressziós szintjét is a RAW 264.7 sejtekben, ami azt jelzi, hogy az RPFRS a citokinek szekréciójának serkentésével képes szabályozni az immunfunkciójukat.
Az RPFRS hatása az NF - κ B útvonalhoz kapcsolódó fehérjék expressziójára RAW 264.7 sejtekben. Az NF - κ B, mint nukleáris transzkripciós faktor, aktiválhatja a korai védelmi válaszokkal kapcsolatos különböző gének kifejeződését, ezáltal szabályozva az olyan élettani folyamatokat, mint a sejt apoptózis, immunválasz, gyulladás és szöveti remodelling. Az NF - κ B jelátviteli útvonal aktiválását különböző jelzőmolekulák serkentik. A TLR2 és TLR4, mint a mintafelismerő receptorcsalád tagjai, nagymértékben expresszálódnak a makrofágok, B-sejtek és DC-sejtek felszínén, és képesek a betegséggel kapcsolatos molekuláris mintákat monitorozni és felismerni, hogy a jelátviteli útvonalban jelátvitelt indítsanak el. Ez utóbbiak a MyD88-at is stimulálhatják, hogy jelkaszkádot indítsanak el és NF - κ B aktivációt indukáljanak. A MyD88 és a TRIF a citoplazmában TLR-kötő fehérjékhez kötődnek, az ubikvitin hatására aktiválják a MAPK-útvonalat, elősegítik az I κ B - α foszforilációt az NF - κ B-útvonal aktiválása érdekében, és szabályozzák a downstream génexpressziót. He és munkatársai megállapították, hogy a Platycodon grandiflorumból származó összes szaponin különböző dózisú beavatkozását követően a kollagén indukálta artritiszes patkányok bokaízületének szinoviális szövetében csökkent az IL-6, IL-1 β és TNF - α szintje, míg a TLR2, TLR4, MyD88 és más fehérjék szintje csökkent. Shin és munkatársai megállapították, hogy a hőkezelt ginsenozidok Rg1 és Rg3 elősegíthetik az IL-6 és TNF - α kiválasztását RAW264.7 sejtekben, valamint a MAPK foszforilációját és az I κ B - α degradációját az NF - κ B jelátviteli útvonal aktiválása érdekében. A kísérlet eredményei azt mutatták, hogy az RPFRS hatására a TLR4 mRNS expressziója a RAW 264.7 sejtekben csökkent, míg a MyD88 és az NF - κ B mRNS expressziója nőtt; Ezzel összhangban a WB eredmények a TLR4, I κ B α és a citoplazmatikus NF - κ B fehérjék expressziójának csökkenését mutatták, míg a TLR2, MyD88, TRIF és a nukleáris NF - κ B fehérjék expressziója nőtt, ami az NF - κ B transzlokációjára utal a citoplazmából a sejtmagba. Az NF - κ B útvonal aktiválását követően képes visszafordítani a pro-inflammatorikus citokinek által közvetített transzkripciós indukciót, ami megfelel a citokin tartalom és mRNS expresszió fent említett eredményeinek. Ez azt jelzi, hogy az RPFRS képes aktiválni a RAW 264.7 sejteket a TLR2 és TLR4 által közvetített TRIF/MyD88-NF - κ B transzdukciós útvonalon keresztül.
Az RPFRS elősegítheti a RAW 246.7 sejtek proliferációját, fokozhatja a fagocita aktivitást, növelheti a kapcsolódó citokinek tartalmát és mRNS expresszióját, lecsökkentheti a TLR4 mRNS expresszióját, felszabályozhatja a TLR2, MyD88, TRIF és a nukleáris NF - κ B fehérje expresszióját, lecsökkentheti a TLR4, I κ B - α és a citoplazmatikus NF - κ B fehérje expresszióját, és bizonyos dózishatást mutat. Az RPFRS immunvédelmet fejthet ki azáltal, hogy gátolja a TLR4 LPS általi stimulációját, és a TLR2/4-MyD88/TRIF-NF - κ B jelátviteli útvonalon keresztül aktiválhatja a RAW 264.7 sejteket is, részt vesz az immunválasz folyamatában és immunszabályozó hatást fejt ki. További kutatásokra van szükség az RPFRS és a RAW 264.7 sejtek immunszabályozásában részt vevő egyéb jelátviteli útvonalak, valamint azok összetevői és az immunaktivitás közötti kapcsolat vizsgálatához.