A kitozán oligoszacharidok védő hatása a dextránsulfát által kiváltott vastagbélgyulladásos egerekre
A gyulladásos bélbetegségek (IBD) közé tartozik a fekélyes vastagbélgyulladás (UC) és a Crohn-betegség (CD). A fekélyes vastagbélgyulladást Wilk és Moxon fedezte fel 1875-ben, Boas és Wilk 1903-ban definiálta, és a WHO 1905-ben hivatalosan is különleges klinikai állapotnak nyilvánította. A fekélyes vastagbélgyulladás egy nem specifikus vastagbélgyulladás, amely főként a vastagbél szigmabélben és a végbélben található. Az elváltozások a nyálkahártyán és a nyálkahártya alatti részen folyamatosan oszlanak el, és lassan kiújulnak. Néhány esetben akut kezdetű is előfordul, amely főként hasi fájdalom, hasmenés és ragacsos, gennyes és véres széklet formájában jelentkezik, különféle extraintestinalis tünetek kíséretében. A fekélyes vastagbélgyulladás pontos etiológiája és patogenezise még mindig nem tisztázott, és általában úgy vélik, hogy különböző tényezőkkel, például fertőzéssel, immunrendszeri rendellenességekkel, genetikai érzékenységgel, környezettel, mentális állapottal és diszbiózissal függ össze. A nyugati országokban nagyon gyakori, 105 emberre 10-20 ember jut, aki ebben szenved, Észak-Amerikában és Nyugat-Európában pedig magasabb az előfordulási arány. Az utóbbi években az UC előfordulása Kínában is emelkedik. Jelenleg a vastagbélgyulladás kezelésére olyan tüneti gyógyszerek állnak rendelkezésre, mint az 5-aminosalicilsav (szulfaszalazin) és az immunszuppresszánsok, de ezek bizonyos mellékhatásokkal járnak, így a biztonságos gyógyszerek keresése a kutatás egyik forró pontjává vált.
A kitozán (CS) hidrolízisével chitooligoszacharidokat (COS) állítanak elő, amelyek polimerizációs foka 2-20, átlagos molekulatömege pedig kevesebb, mint 3900 Da. Molekulatömege kicsi, vízben könnyen oldódik, és a biológiai szervezetek közvetlenül felszívódhatnak. Olyan biológiai aktivitásokkal rendelkezik, mint a zsírcsökkentés, a vércukorszint csökkentése, a baktériumok gátlása, a rák elleni küzdelem és a gyulladáscsökkentés, és nincs toxikus mellékhatása. Széles körben felhasználható különböző területeken, például az orvostudományban, a kozmetikában, az élelmiszeriparban és a mezőgazdaságban. A kitozánt a kitin deacetilezésével nyerik, amely a világon a második leggyakoribb polimer a cellulóz után (általában rákfélék héjában, rovarok epidermiszében és gombák sejtfalában található). Jelenleg a kitozán oligoszacharidok vastagbélgyulladásra gyakorolt hatásával kapcsolatban született néhány tanulmány, például Yang és munkatársai felfedezték, hogy a kitozán oligoszacharidok az AMPK és az NF - κ B révén védőhatást érhetnek el a vastagbélgyulladásra. Az alkalmazási koncentráció azonban lényegesen magasabb (általában 500 mg/kg, ami kb. 3,6 g-os emberi dózisnak felel meg), ami messze meghaladja a 0,5 g/nap nemzeti ajánlott beviteli dózist (lásd a hat új élelmiszer-összetevő, köztük a kitozán-oligoszacharidok jóváhagyásáról szóló közleményt (2014. évi 6. sz.), ami 70 mg/kg-os egérdózisnak felel meg). Yousef megállapította, hogy a kitozán oligoszacharidok 20 mg/kg dózisban szintén védőhatást fejthetnek ki a vastagbélgyulladásra ecetsav infúziós vastagbélgyulladás modell és bélhámsejtes kísérletek segítségével. Ezért ez a cikk elsősorban 3% DSS ivóvízzel kiváltott colitis egérmodellt használ a kitozán oligoszacharidok beavatkozásának ellenőrzésére a colitisre különböző dózisokban (70 és 140 mg/kg), feltárja a kitozán oligoszacharidok szerepét a colitis tüneteinek és az egerek fiziológiai állapotának szabályozásában, és adatokat szolgáltat a kitozán oligoszacharidok védőhatásának további kutatásához a DSS indukált colitis egerekre gyakorolt védőhatásának alátámasztására. Ebben a kísérletben 50 hím C57BL/6 egeret véletlenszerűen 5 csoportra osztottak: vak csoport, modellcsoport, pozitív csoport (SASP, 50 mg/kg), valamint alacsony - és magas dózisú kitozán csoport (70 és 140 mg/kg) 3% nátriumdextránsulfátot (DSS) tartalmazó vízzel történő ivással 7 napig, hogy modellt hozzanak létre. A chitooligoszacharidok hatásának értékelése a testsúlyváltozás, a betegség aktivitási index, a patológiai pontszám és a myeloperoxidáz aktivitás révén. A vastagbélgyulladásban a gyulladásos faktorok szintjének kimutatása ELISA segítségével.

A DSS vastagbélgyulladásos modell egy nemzetközileg elismert és széles körben használt kísérleti UC állatmodell, amelyet 1990-ben hoztak létre. Kóros elváltozásai közé tartozik a fekélyképződés, a kriptatályog, a kisérgyulladás, a goblet sejtek csökkenése és a különböző gyulladásos sejtek beszivárgása, amelyek hasonlóak a humán vastagbélgyulladás klinikai tüneteihez. A kitozán országosan ajánlott humán dózisa 0,5 g/fő, ami egérre átszámítva 70 mg/kg dózist jelent. Ezért ezt a modellt felhasználva két kitozán dózist választottunk, 70 mg/kg és 140 mg/kg, hogy megvizsgáljuk a DSS által kiváltott vastagbélgyulladásra gyakorolt beavatkozási hatásukat. Egy koreai szakirodalom akut toxicitási kísérleteket végzett oligoszacharidokkal, és megállapította, hogy az oligoszacharidok LD50 értéke egerekben meghaladta az 5,0 g/kg-ot. Zhao és munkatársai a kitozán funkcionális élelmiszerek biztonsági értékelésében kimutatták, hogy egereknek (1,25 g/kg/nap) és patkányoknak (1,47 g/kg/nap) történő beadást követő 10 napon belül (a klinikailag ajánlott dózis kb. 312-368-szorosa) nem észleltek akut toxikus reakciókat. Ebben a kísérletben fekélyes vastagbélgyulladás modellt állítottak fel úgy, hogy az egerek 7 napon keresztül szabadon ihattak 3% DSS-t. A kísérlet 6. napján a modellcsoportba tartozó egereknél a vastagbélgyulladás tipikus élettani tüneteit figyelték meg, mint például fogyás, étvágytalanság, egyenetlen szőrzet, hasmenés, véres, ragadós széklet, sőt végbélvérzés. A nyolcadik napon a boncolás során megállapították, hogy a modellcsoportba tartozó egerek vastagbele megrövidült, a vastagbélszövet pedig pangásos és ödémás volt. A HE-festés a vastagbél nyálkahártya ödémáját, hiányos hámsejteket, a kripták mirigyes szerkezetének eltűnését és súlyos gyulladásos infiltrációt mutatott ki. A fenti tünetek javultak a kis dózisú (70 mg/kg) és a nagy dózisú (140 mg/kg) kitozán beavatkozással kezelt egereknél. Yousef és munkatársai eredményeivel összhangban rámutatott, hogy a kitozán oligoszacharidok csökkenthetik a bélhámsejtek apoptózisát, gátolhatják a gyulladást, és védhetik a bélhám gátjának strukturális és funkcionális integritását. Egyes tanulmányok szerint a gyulladásos bélbetegséget a bélhám gátjának hibái és a nyálkahártya immunválaszának diszregulációja okozza. A kitozán oligoszacharidok képesek megvédeni a bélhámsejteket, ami a bélgyulladásban betöltött fontos védő szerepükre utal. Ebben a kísérletben a kitozán 70 mg/kg dózisú csoportja szignifikáns különbséget mutatott a modellcsoporthoz képest a vastagbél rövidülésének javításában, a vastagbél nyálkahártya-ödéma enyhítésében, valamint a goblet sejtek és a kriptaszerkezetek védelmében. A 140 mg/kg dózisú csoport azonban nem mutatott szignifikáns különbséget a vastagbél rövidülésének javításában a modellcsoporthoz képest, és csak a patológiai szöveti pontszámok javításában volt szignifikáns különbség. Ez azt jelzi, hogy az alacsony dózisú kitozán csoport jobb védőhatással rendelkezik a DSS által kiváltott vastagbélgyulladásos egerekre. Az eredmények azt mutatták, hogy a 70 mg/kg kitozán dózis bizonyos hatással volt a vastagbél rövidülésének enyhítésére és a vastagbél szerkezetének védelmére egerekben, ami hasznos a kitozán fejlesztéséhez és alkalmazásához az országosan ajánlott dózisban.

Jelenleg az IBD fő kezelési irányai az oxidatív stressz és a gyulladás. Úgy vélik, hogy az oxidatív stressz az IBD patogén alapja, és a túlzott oxigén szabad gyökök kulcsfontosságú tényező a fekélyes gyulladásos szövetkárosodás és a vastagbélgyulladás kialakulásában. Az MDA termelésével a túlzott NO oxigén szabad gyököket termel, ami oxidatív károsodást okoz, és nagyszámú gyulladásos sejt beszivárgásához vezet a szövetekben. A neutrofilek a leggyorsabban a gyulladás helyére toborzott immunsejtek az UC korai szakaszában. Kettős funkcióval rendelkeznek. Egyrészt aggregálódik a hámsejtek kriptáiban és a bélüregekben, és IL-1, IL-6, MPO stb. kiválasztásával reaktív oxigénfajok (ROS) felszabadításával további szövetkárosodást indukál. Másrészt aktívan fenntartja a szöveti homeosztázist azáltal, hogy gyulladáscsökkentő faktorokat választ ki, és korlátozhatja a mikrobiális inváziót. Qiao és munkatársai megállapították, hogy a kitozán oligoszacharidok csökkenthetik a neutrofilek beszivárgását és a lipidperoxidációt a sérült szervekben LPS indukálta szepszis egérmodellekben. Dou és munkatársai megállapították, hogy a kitozán oligoszacharidok képesek gátolni a reaktív oxigénfajok termelését, az aktivált neutrofilek degranulációját és adhézióját nyulakban, ezáltal gyulladáscsökkentő hatást fejtve ki. A mieloperoxidáz-érték (MPO) a szövetkárosodás és a neutrofil (PMN) infiltráció markere, amely nyálkahártya-szakadáshoz és fekélyesedéshez vezethet, és szorosan összefügg az IBD-vel.

A kísérlet során az MPO-aktivitás a vastagbélgyulladásos modellcsoport egereinél jelentősen megnövekedett a vak csoporthoz képest, ami a neutrofilek jelentős növekedését jelezte a bélszövetben és a súlyos infiltrációt. A kitozán oligoszacharid beavatkozás után az MPO-aktivitás a vastagbélszövetben csökkent, bár nem különbözött jelentősen a modellcsoporttól, tendencia volt a neutrofil aggregáció lassítása a bélben és a további szövetkárosodás csökkentése. Ez összhangban van Dou és munkatársai felfedezésével, miszerint a kitozán oligoszacharidok elősegíthetik a neutrofil apoptózist és csökkenthetik az MPO felszabadulást glikogén peritonitiszben szenvedő egerekben. Feltételezhető, hogy ez a PLD és a PI3K aktiválásával függhet össze, ami a neutrofilek szuperoxid és más anyagok termelését indukálja.

Az UC több tényező együttes hatásának eredménye, amelyek között a citokinek is fontos szerepet játszanak. Az IL-6 alacsony koncentrációban serkenti a T-sejtek proliferációját, magas koncentrációban aktiválja a B-sejtek proliferációját, antitesteket választ ki, és részt vesz a szervezet gyulladásos válaszában. TNF-α， Más néven tumor nekrózis faktor alfa, az aktivált makrofágok II monociták termelik, és elősegíti az apoptózist. Az IL-6 és a TNF - α, mint két fontos gyulladásos citokin, a szervezetben a patogén ingerekre adott leggyorsabb és legjelentősebb gyulladásos faktorok. Gyakran előfordulnak különböző patológiás folyamatokban, például immunbetegségekben, gyulladásos válaszokban és tumorimmunitásban. Az UC betegek vastagbélnyálkahártya-szövetében az IL-6 és a TNF - α expressziója sokkal magasabb az aktív fázisban, mint a remissziós fázisban, és fontos szerepet játszanak a bélnyálkahártya gyulladásában és immunválaszában is, és az IBD-t közvetítő kulcsfontosságú citokineknek tekintik őket. A nukleáris kappa B faktor (NF - κ B) a gyulladásos citokinek expressziójával kapcsolatos fontos transzkripciós faktor. Amikor a szervezetet stimulálják, az I - κ B aktiválódhat és lebomolhat, aktiválva az NF - κ B-t a citoplazmában és a sejtmagba jutva, géntranszkripciót indukálva, és különböző gyulladásos vagy kemokineket, például IL-1 β, IL-6, IL-12 és TNF - α-t generálva, amelyek a visszacsatolásos erősítés révén tovább fokozódnak. Youself és munkatársai úgy vélik, hogy a chitooligoszacharidok az NF - κ B útvonal gátlásával enyhítik a szervezet gyulladásos reakcióit. Ebben a kísérletben az IL-6 és a TNF - α expressziója a fekélyes vastagbélgyulladásos egerek vastagbélszövetében jelentősen megnövekedett, míg a kitozán oligoszacharidok alacsony és magas dózisú beavatkozása jelentősen csökkentette az expressziós szintjüket, ami összhangban van Yang és Youself et al. eredményeivel, ami azt jelzi, hogy az oligoszacharidok hatékonyan javíthatják a vastagbélgyulladás tüneteit a gyulladásos reakciók enyhítésével.

A kitozán oligoszacharidok két dózisának kísérleti eredményeit összehasonlítva megállapították, hogy a kitozán oligoszacharidok mindkét dózisa lassította a DSS által kiváltott fogyást, a vastagbél rövidülését, és gátolta a betegség aktivitási indexét, valamint növelte az MPO-aktivitást. Jelentősen javították a szövettani elváltozásokat és növelték a szöveti TNF - α és IL-6 szinteket. Közülük a kis dózisú és a nagy dózisú csoportnak jobb hatása volt a vastagbél hosszának és a szövettani változások enyhítésére. Ez azt jelzi, hogy a COS alacsony dózisú csoportjának jobb hatása van a vastagbélgyulladás tüneteinek enyhítésében. Yousef és munkatársai 1, 5, 10, 20, 50 és 100 mg/kg dózisban kezelték a vastagbélgyulladásos egereket COS-szal, és megállapították, hogy a 10 és 20 mg/kg COS-nak volt a legjobb hatása. Hasonló harang alakú összefüggést figyeltek meg a COS dózisa és hatása között az LPS és TNF - α által indukált T84 sejtekben is, ami arra utal, hogy a COS két különböző jelátviteli útvonalat stimulálhat, ellentétes hatást fejthet ki, és funkcionális antagonizmust okozhat. A dózishatás közötti összefüggést laboratóriumunk korábbi vizsgálataiban is találtuk. Ding 35, 70, 140 és 210 mg/kg dózisban alkalmazta a COS-t alkoholos zsírmájas egereken, és azt találta, hogy a 70 és 140 mg/kg-os csoportnak jobb volt a védőhatása. Az ebben a cikkben kiválasztott 70 és 140 mg/kg COS a harangforma közepén és hátulján helyezkedhet el, és a kísérleti eredmények azt mutatják, hogy az alacsony dózisú csoport kissé jobb hatással rendelkezik, mint a magas dózisú csoport.

Összefoglalva, a kitozán oligoszacharidok hatékonyan enyhíthetik a DSS által kiváltott vastagbélgyulladás tüneteit. Közülük a 70 mg/kg kitozán oligoszacharidok hatékonyabban enyhítik a vastagbél hosszát és a szövettani elváltozásokat, mint a 140 mg/kg, és alkalmasabbak az emberi alkalmazásra ajánlott dózisoknál. Eközben a kitozán oligoszacharidok szerepet játszhatnak a gyulladás csökkentésében és az IBD tüneteinek enyhítésében a neutrofil infiltráció mérséklésével és a pro-inflammatorikus citokinek felszabadulásának gátlásával. A gyulladásos citokinek felszabadulásának gátlásában a kitooligoszacharidok specifikus hatásmechanizmusa azonban még további ellenőrzésre szorul.