A huperzin-A inkrementális dúsításának elősegítése szimbionta termesztési módszerrel
A Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) a Taxaceae családba, azon belül a Taxodium nemzetségbe tartozó páfrányfélék közé tartozó növény. Ritka kínai gyógynövény, amelyet traumás sérülések kezelésére, méregtelenítésre, fájdalomcsillapításra és skizofrénia kezelésére használnak. A kígyótalpú fenyő jelenleg az egyik legjobban kutatott gyógyszer az Alzheimer-kór kezelésére. Hatóanyaga, a huperzin-A, hatékony, alacsony toxicitású, reverzibilis és nagy szelektivitású acetilkolin-észteráz (AChE) gátló a myasthenia gravis és az Alzheimer-kór kezelésére. Fokozhatja az acetilkolin, a figyelemhez, az éberséghez, a koncentrációhoz és a memóriához kapcsolódó központi idegrendszeri neurotranszmitter hatását. A huperzin A-t 1982-ben sikeresen izolálták a kígyófűből, és a "remény csillagának" tekintették. Egy felmérés szerint 2025-re a fejlett országokban a 65 éves és idősebb Alzheimer-kóros betegek száma eléri a 7,1 milliót, ami közel 29% növekedés a 2018-as 5,5 millióhoz képest. Hacsak nem történik orvosi áttörés, a betegségben szenvedő betegek száma 2050-re 5,5 millióról 13,8 millióra nőhet. Csak az Egyesült Államokban 100000 emberből körülbelül 14-20 szenved myasthenia gravisban, összesen mintegy 36000-60000 beteg, ami szintén nagyon riasztó szám. Az Alzheimer-kór és a myasthenia gravis kezelésére jelenleg forgalomban lévő gyógyszerek legnagyobb problémája a gyógyszer-toxicitás és a rezisztencia. A jelenlegi gyógyszerekkel összehasonlítva a huperzin A egy természetes növényi kivonat, amely jó biztonságú, kevesebb mellékhatással rendelkezik, és gyorsan felszívódik az emberi szervezetben. A gátlási módszer a kompetitív és nem kompetitív gátlás vegyes típusa, és a terápiás hatás jelentős, hosszú hatásidővel.
A kígyólábú Cryptomeria az egész világon elterjedt, de a készletei nagyon korlátozottak. Az egyik korlátozó tényező a kígyólábú Cryptomeria lassú növekedése, amely a spórától az érettségig legalább 15 évet vesz igénybe. Érett állapotban pedig a kígyólábú fenyő magassága mindössze 10-30 cm. Ugyanakkor a növekedési környezetét nehéz reprodukálni és nehéz elősegíteni a tényleges termesztési folyamatokban. Ezért a közeljövőben a kígyótalpú fenyőt a kihalás veszélye fenyegeti. Az elmúlt években több tanulmányt is folytattak ezzel a ritka növénnyel kapcsolatban, például az explantátumok és kalluszszövetek in vitro termesztésével. Kan'ichiro Ishiuchi csapata egymás után kezdte H A szaporítóanyagokat a Pinifolia szárcsúcsából nyerték, és steril táptalajon 2 cikluson keresztül (minden ciklus 7 nap) tenyésztették. Végül az explantátumokat sikeresen átültették a kallusztenyésztő táptalajba. Ezenkívül a kutatók különböző fejlesztéseket végeztek a Huperzia serrata tenyésztési módszerével kapcsolatban, mint például a táptalajkomponensek szűrése és a szárcsúcs-kultúra technológiájának kutatása. Azonban a szövettenyésztés során az explantátumok fertőtlenítésének és sterilizálásának problémáját nem sikerült hatékonyan megoldani, ami korlátozza a huperzin A nagyüzemi termelését. A természeti erőforrások szűkössége és a fent említett okok miatt sürgősen szükség van egy olyan új módszerre, amely alacsonyabb költséggel képes növelni a huperzin A-tartalmat.
Az endofita gombák a növények szár- és levélszöveteiben élő gombafajok közé tartoznak. Tanulmányok megállapították, hogy ha az endofita gombák hosszú ideig szimbiózisban fejlődnek a növényekkel, genetikai rekombináció révén átvehetik a gazdanövény bizonyos génjeit, és olyan másodlagos anyagcseretermékeket állíthatnak elő, amelyek megegyeznek a gazdanövény génjeivel. Eközben az endofita gombák hormonokat is termelhetnek, amelyek elősegítik a gazdanövények növekedését és fejlődését. Ezért a ko-kultúrás rendszerben az endofita gombákat elicitorként tekintik, ami azt jelenti, hogy a növényi sejtek egy bizonyos koncentrációtartományon belül ko-kultúrázhatnak endofita gombákkal. A ko-kultúrás rendszerben az endofita gombák és a növényi sejtek kölcsönhatásba lépnek egymással, elősegítve a növényi termékek felhalmozódását. Az ergoszterol a gombák sejtmembránjának fontos összetevője és a gombák jellegzetes szterinje. Reprezentatív indikátorként használható a gombák biomasszájának mérésére.
Ez a tanulmány egy újszerű ko-kultúra rendszert (CCS) mutat be a kínai fenyő huperzin-A-tartalmának gazdaságos és kényelmes növelése érdekében, hogy javítson a jelenlegi helyzeten, ahol a kínai fenyő az erőforrások szűkössége miatt nem használható széles körben.

A huperzin A egy AChE-gátló, amelyet az Alzheimer-kór és a myasthenia gravis kezelésére használnak. Fő forrása a Cryptomeria lanceolata, de a Cryptomeria lanceolata Huperzine A-tartalma alacsony, és a Cryptomeria lanceolata korlátozott erőforrásai korlátozzák a további fejlesztését a gyógyszeriparban. Vannak olyan tanulmányok, amelyek azt mutatják, hogy a növényekben különböző endofita gombák vannak, amelyek a hosszú távú evolúció során komplex mutualista kapcsolatot alakítottak ki gazdanövényeikkel. Egyrészt az endofita gombáknak saját túlélési szükségleteik kielégítéséhez tápanyagokat kell felvenniük a növényekből. Másrészt az endofita gombák különleges biokémiai kommunikációt folytatnak a gazdanövényekkel, hogy ellenálljanak a gazdanövény védelmi rendszerének. A gazdaszervezet kémiai jelzéseinek felismerésével vagy a gazdaszervezet enzimrendszereinek alkalmazásával a gazdaszervezethez hasonló másodlagos anyagcseretermékeket képesek szintetizálni. Jiang és munkatársai endofita gombákat izoláltak és tisztítottak a Hibiscus félig vörös mangrove növényből, és szilárd állapotú fermentációval a gazdanövénnyel azonos másodlagos metabolitokat nyertek. Tong és munkatársai izolálták és tanulmányozták a Cryptomeria serrata FS4 endofita gomba másodlagos metabolitjait, és megállapították, hogy öt metabolitja a huperzin A-hoz hasonlóan erős acetilkolin-észteráz gátló biológiai aktivitást mutat.
Ebben a tanulmányban kísérleteket végeztek a vadon élő kígyófűzfű háziasítási körülményeivel és szövettenyésztési táptalajával kapcsolatban. Az optimális tenyésztési feltételeket 100 Lux fényintenzitás, 95% páratartalom, MS folyékony táptalaj, 20,0g/L szacharóz, 2,4-D5,0mg/L és KT1,0mg/L szacharóznak határozták meg. Két vegyület, a huperzin-A és az ergoszterin relatív változását használtuk a CCS dinamikus növekedési folyamatának tükrözésére. A negyedik napot határoztuk meg a betakarítás és a szubkultúra optimális időpontjaként, annak inflexiós pontja alapján. A CCS 4 napos tenyésztése után a huperzin-A-tartalom 49,34%-tel nőtt, elérve a maximális értéket. A huperzin-A teljes tartalma a tenyésztési rendszerben először növekvő, majd csökkenő tendenciát mutatott. Ennek az az oka, hogy a növekedés későbbi szakaszában az endofita gombák erősebb szaporodási képességgel rendelkeznek, mint a növényi sejtek differenciálódási képessége, versengenek a tápanyagokért és a tenyésztőközegben lévő növekedési térért, ami a sejtek számának csökkenését eredményezi. Ezért a betakarítás és a szubkultúra idejének megválasztása a kulcsa a huperzin-A fokozatos dúsításának eléréséhez a ko-kultúrás rendszerben. Ugyanakkor a 2,4-D növényi hormon koncentrációja jelentős hatással van a rendszerre. A 2,4-D elősegíti a növényi szervek dedifferenciálódását és a kalluszszövet indukcióját, de túl magas koncentráció esetén gátló hatással van a sejtdifferenciálódásra. Ezért a tenyésztési rendszerben 5 mg/l az optimális koncentráció. Ez a kísérlet sikeresen használt egy ko-kultúra rendszert a huperzin A bioszintézisének eléréséhez. Ez a módszer felülmúlja a hagyományos rögzített koncepciókat, mivel a növényi szomatikus sejtkultúra nem igényel alapos előzetes sterilizálást. A növényi szomatikus sejtek és az endofita gombák együttesen tenyészthetők, és a huperzin A termelése meghatározott arányban elősegíthető. Amíg a tenyésztési ciklus pontosan megragadható, ez a kényelmes és gyors módszer használható a huperzin-A felhalmozására, ami nagy jelentőséggel bír a növényi erőforrások védelme és a huperzin-A fontos bioaktív anyagainak gazdagítása szempontjából.