Előzetes tanulmány az Nrf2 jelátviteli útvonalat aktiváló icariin védőhatásáról a D-galaktóz által kiváltott sérülésekkel szemben egér herék Sertoli 15P-1 sejtjeiben.
A gazdaság és a társadalom folyamatos fejlődésével és az emberek túlélésére nehezedő növekvő nyomással a meddőség globális problémává vált. A kutatások szerint világszerte a párok mintegy 15%-je szenved meddőségben, a férfi tényezők mintegy 50%-ért felelősek, és a mechanizmus még nem teljesen tisztázott. A herék Sertoli-sejtjei, mint az egyetlen szomatikus sejtek, amelyek a spermatogén sejtekhez kapcsolódnak, strukturálisan körülveszik a spermatogonialis őssejteket, a spermatogoniumokat és a spermatogén sejtek különböző szintjeit, és különböző szoros kötésfehérjék, mint például az Occludin és a Claudin-1 révén vérherék gátat képeznek. A kutatások kimutatták, hogy a herét támogató sejtek különböző növekedési faktorokat, például gliasejtvonalból származó neurotrofikus faktort (GDNF), csontmorfogenetikus protein-4-et (BMP4) és őssejtfaktort (SCF) választanak ki, amelyek szabályozzák a spermatogonialis őssejtek proliferációját és differenciálódását, és elősegítik a spermiumképződést. Egy másik tanulmány megállapította, hogy a terhesség alatt hat vegyértékű krómnak kitett hím patkányoknál felnőttkor után a támasztósejtekben az Occludin és a Claudin-1 szoros kötésfehérjék expressziójának downregulációját mutatták ki, ami a spermatogén sejtek fokozott apoptózisához és károsodott spermiumtermeléshez vezetett. Hőstressz-stimuláció hatására a szarvasmarha herék Sertoli-sejtjei károsodnak, és a GDNF és SCF mRNS szintje lefelé szabályozódik, ami a spermiumok diszfunkciójához vezet. Ezért a támogató sejtek szerkezetének és működésének javítása új irányt jelenthet a férfi meddőség kezelésében.

Az Epimedium egy hagyományos kínai gyógynövény, amely tápláló tulajdonságokkal rendelkezik, és először a "Shennong Bencao Jing"-ben szerepel. A vese-jang tonizáló, az izmokat és a csontokat erősítő, valamint a szelet és a nedvességet elűző hatása van. A modern farmakológiai kutatások kimutatták, hogy az Epimedium jelentős hatással van az öregedés késleltetésére és a férfi reproduktív funkciók fokozására. Fő hatóanyaga az icariin (ICA). Vizsgálatok megállapították, hogy az ICA patkányokban elősegíti az elsődleges Sertoli-sejtek proliferációját és fokozza a hím Sertoli-sejtek működését. A kutatások kimutatták, hogy az ICA fokozhatja a patkányok reproduktív funkcióját azáltal, hogy növeli a tüszőstimuláló hormon receptorok és a Claudin-11 szoros kötésfehérje mRNS expressziós szintjét a támogató sejtekben, ezáltal javítja a hereszövet antioxidáns stressz-rezisztenciáját. A nukleáris faktor erythroidszerű 2 (Nrf2), mint a szervezet sejtes védelmi rendszerének fő szabályozója, az antioxidáns fehérjéket és az oxidatív stresszre adott válaszfehérjéket kódoló gének sorozatának kifejeződését szabályozza azáltal, hogy az antioxidáns válaszelemek (ARE) promóter szabályozó régiójában lévő enhancer szekvenciákhoz kötődik, koordinálja a különböző stresszkörülményekre és káros támadásokra adott válaszok finomhangolását, valamint a sejtek mikrokörnyezetének homeosztázisát. A kutatások szerint az Epimedium az Nrf2 aktiválásával enyhítheti az oxidatív stressz okozta májkárosodást. Korábbi kutatásaink azt találták, hogy az ICA az Nrf2 felszabályozásával enyhítheti a természetes módon öregedő patkányok herék csírasejtjeinek DNS-károsodását. Az ICA képes felszabályozni az Occludin és a Claudin-1 szoros kötéssel kapcsolatos fehérjék fehérjeexpresszióját a D-Gal által indukált egér heretámogató sejtvonal TM4-ben. Jelenleg azonban nincs kutatási jelentés arról, hogy az ICA képes-e javítani a D-Gal által indukált 15P-1 sejtkárosodást az Nrf2 jelátviteli útvonalon keresztül. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a D-Gal szoros kötéskárosodást indukálhat az egér herék támogató sejtvonal TM4 sejtjeiben. Ezért ez a kísérlet a D-galaktóz (D-Gal) - indukált 15P-1 sejteket használta károsodási modellként, hogy feltárja az ICA védő hatását és mechanizmusát a Sertoli sejtek károsodására az Nrf2 jelátviteli útvonalból.

Az elmúlt években a WHO a meddőséget közegészségügyi problémaként ismerte el. A meddőség előfordulási aránya az általános népességben évről évre nőtt, és a szülőképes korú párok mintegy 15%-ét érinti a világon. A kutatások szerint az Egyesült Államokban és más nyugati országokban a spermiumok száma évente 1,5%-tel csökken, és becslések szerint világszerte közel 70 millió pár vált meddőség vagy sterilitás áldozatává. A WHO által végzett nagyszabású járványügyi felmérés megállapította, hogy a párok meddőségének mintegy felét férfi tényezők okozzák, és a mechanizmus még nem teljesen tisztázott.

A kutatások megállapították, hogy a D-Gal képes csökkenteni az egér TM4 sejtvonal támogató sejtjeinek számát és működését. Ezért a D-Gal modellt választottuk annak értékelésére, hogy az ICA képes-e enyhíteni a 15P-1 sejtek károsodását. Vannak irodalmi beszámolók arról, hogy 35, 70 és 140 μ M ICA-val történő kezelés után az ECV-304 endotélsejteken a sejtgátlási arány 1,2% volt, és nem volt jelentős citotoxicitás. A kísérlet MTT-eredményei azt mutatták, hogy a kontrollcsoporttal összehasonlítva, amikor az ICA-t önmagában használták a 15P-1 sejtek kezelésére, az IC50 nagyobb volt, mint 50% 40 μ M koncentrációnál, ami azt jelzi, hogy az ICA nem rendelkezik jelentős citotoxicitással. Előzetes kutatásaink azt találták, hogy az ICA védő hatással van a D-Gal-lal kezelt TM4 sejtkárosodásra, és jelentős proliferatív hatással rendelkezik 0,5 és 1 μ M koncentrációban. A kísérlet MTT eredményei azt is kimutatták, hogy a D-Gal kezelési csoporttal összehasonlítva az ICA koncentrációfüggő módon növelte a sejtek túlélési arányát 0,125-1 μ M koncentrációban, és jelentős elősegítő hatással volt a sejtproliferációra 0 μ M koncentrációban.5 és 1 μ M. Az ICA elősegítő hatása gyengült, amikor a koncentráció nagyobb volt, mint 1 μ M, ami a D-Gal 15P-1 sejtekre gyakorolt hosszabb stimulációs idejének, a súlyosabb sejtkárosodásnak és a károsodott sejtek gyógyszeres stimulációval szembeni fokozott érzékenységének tudható be ebben a kísérletben, így az alacsony koncentrációjú elősegítés és a magas koncentrációjú gátlás jelenségét mutatja. A herék Sertoli-sejtjei a herék szeminiferosus tubulusaiban található szomatikus sejtek, amelyek közvetlenül kapcsolódnak a spermatogén sejtekhez. Szabályozzák a spermatogoniális őssejtek proliferációját és differenciálódását, és különböző citokinek, például GDNF, BMP4 és SCF szekréciójával elősegítik a spermiumképződést. A GDNF a transzformáló növekedési faktor béta szupercsalád tagja, és fontos tényező a spermatogonialis őssejtek proliferációjának szabályozásában. Kulcsfontosságú szerepet játszik a hímivarsejtek fejlődésében és a korai herék fejlődésében. A BMP4 és az SCF fontos faktorok, amelyek elősegítik a spermatogoniális őssejtek differenciálódását. Kutatócsoportunk korábbi kutatásai kimutatták, hogy az Epimedium teljes flavonoidjai képesek felszabályozni a GDNF, BMP4 és SCF mRNS- és fehérjeszintjét, amelyet a Sertoli sejtek szekretálnak a természetesen öregedő patkány herékben, javítva a Sertoli sejtek szekréciós funkcióját. Az eredmények azt mutatták, hogy a kontrollcsoporthoz képest a D-Gal-kezelést követően a Sertoli-sejtek szekretált faktorainak mRNS- és fehérje-expressziós szintje jelentősen csökkent, míg a 15P-1-ben az ICA kezelést követően a Sertoli-sejtek szekretált faktorainak mRNS- és fehérje-expressziós szintje jelentősen felszabályozódott. Az ICA javíthatja a 15P-1 herék Sertoli sejtjeinek szekréciós funkcióját.

A támasztósejtek közötti szoros kötések a vértestgát legfontosabb alkotóelemei, amelyek elsősorban a három transzmembrán fehérjecsaládot, az Occludin, a Claudin és az adhéziós fehérjéket, valamint a blokkoló kötés citoplazmatikus fehérjecsaládját foglalják magukban. A sejtek közötti szoros kötések nemcsak a reproduktív sejteket védik az immunrendszer inváziójától, és jó fiziológiai környezetet biztosítanak a spermatogenezis számára, hanem lehetővé teszik a prefinom és posztfinom spermatociták számára is, hogy rendszeresen áthaladjanak a vér here gáton a további fejlődés érdekében. A kutatások megállapították, hogy az Occludin és a Claudin a legkorábban azonosított tight junction membránfehérjék, és a tight junction képességet és a hámgát funkcióját elsősorban a Claudin közvetíti. Egy másik tanulmány kimutatta, hogy szintetikus Occludin peptid patkányherékbe történő befecskendezése 27 nap után reverzibilisen ablálhatja a legtöbb spermatogónia működését, míg az Occludin in vitro kiütése szintén a támogató sejtek szoros kötés funkciójának csökkenéséhez vezethet. A kísérlet eredményei azt mutatták, hogy a kontrollcsoporthoz képest a 15P-1 sejtekben a D-Gal kezelést követően csökkent a szoros kötésfehérje expressziója, míg a 15P-1 támasztósejtekben a szoros kötésfehérje expressziója az ICA kezelést követően jelentősen felszabályozódott. Az ICA védő hatással van a 15P-1 támasztósejtekben a feszes kötésfehérje károsodására.

Amikor a szervezet normális állapotban van, a Kelch like ECH associated protein-1 (Keap1) toborozza az Nrf2-t, és komplexet alkot a citoplazmában, amelyet ubikvitin proteáz bont le; amikor oxidatív stressz lép fel, az Nrf2 disszociál a Keap1-ről, és az Nrf2 a citoplazmából a sejtmagba kerül, hogy az ARE-hez kötődjön, aktiválva a downstream védő gének, például a HO-1 és az NQO1 transzkripcióját, ezáltal ellenállva a szervezetet érő különböző ingerek által okozott oxidatív stressz okozta károsodásnak. Korábbi kutatásaink kimutatták, hogy az ICA enyhítheti a herék DNS-károsodását a természetes módon öregedő patkányokban, és javíthatja az öregedés okozta reproduktív funkciócsökkenést az Nrf2/HO-1 jelátviteli útvonal aktiválásával. Ez arra utal, hogy az ICA spermatogén diszfunkció javulása az Nrf2 jelátviteli útvonalhoz kapcsolódhat. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az ICA javíthatja a D-Gal által kiváltott heretámogató sejtvonal TM4 sejtkárosodását. Ezért ez a tanulmány Western blotot használt az Nrf2 útvonal fehérjéinek kimutatására. Az eredmények azt mutatták, hogy a kontrollcsoporthoz képest a 15P-1 sejtekben a fontos Nrf2 útvonal fehérjéinek Nrf2, HO-1 és NQO-1 expressziós szintje a D-Gal stimuláció után jelentősen lecsökkent, míg az ICA beadása után jelentősen megnövekedett. Ezt követően immunfluoreszcens technológiával tovább detektáltuk az Nrf2 expresszióját és lokalizációját. A normál kontrollcsoporttal összehasonlítva a D-Gal kezelési csoportban az Nrf2 fluoreszcens expressziója a 15P-1 sejtek magjában gyengült, de javult az ICA kezelés után. A fenti eredmények arra utalnak, hogy a 15P-1 sejtek funkcionális és szerkezeti károsodása az Nrf2 jelátviteli útvonal downregulációjával függ össze, ami a sejtek antioxidáns kapacitásának csökkenéséhez vezet. Az ICA javíthatja a 15P-1 sejtek károsodását antioxidáns kapacitásuk fokozásával.

Összefoglalva, az ICA az Nrf2 jelátviteli útvonal aktiválásával képes felszabályozni a GDNF, BMP4, SCF, valamint az Occludin és Claudin-1 szekréciós fehérjék expressziós szintjét a 15P-1 sejtekben, ezáltal javítva a D-Gal által kiváltott károsodást a 15P-1 sejtekben. Ez a kísérlet elméleti alapot teremtett az ICA csírasejtekre gyakorolt védő hatásának és mechanizmusának későbbi kutatásához, hogy jobban feltárjuk az Epimedium kínai gyógynövény alkalmazási értékét a reproduktív rendszerben, és új irányokat adjunk a férfi meddőség klinikai kezeléséhez.