A dehidroabietinsav, mint a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal gátlója potenciáljának elemzése számítógépes szimulációs technológia alapján
A PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal fontos szerepet játszik a sejtproliferáció, a differenciálódás és az apoptózis folyamatában, és számos tumorsejtben túlműködik. Úgy találták, hogy elősegíti a tumorsejtek gyógyszerrezisztenciájának kialakulását. E jelátviteli útvonal aktiválásának gátlása elősegítheti a tumorsejtek apoptózisát és helyreállíthatja a tumorsejtek gyógyszerekkel szembeni érzékenységét. Ezért a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonalat gátló kis molekulák kifejlesztése a daganatellenes gyógyszerek kutatásának egyik forró pontjává vált. A dehidroabietinsav (DHA) egy fontos triciklikus diterpenoid természetes gyantasav és a hagyományos kínai gyógyászat gyanta egyik összetevője. Főleg a gyanta szétválasztásával nyerik disproporcionálási reakcióval. Stabil tulajdonságokkal és a szteroid molekulákhoz hasonló szerkezettel rendelkezik, és széles körben használják fluoreszcens reagensek és gyógyszer-közvetítők szintézisében és fejlesztésében. A dehidroabietinsav és számos származéka kiváló daganatellenes aktivitást mutat. A legújabb jelentések azt mutatták, hogy a dehidroabietinsav 1H benzo [d] imidazol-származékai gátló hatással vannak a PI3K α-ra, és lecsökkentik a foszforilált AKT expresszióját. Kutatásaink azt is megállapították, hogy egyes B-gyűrűvel módosított dehidroabietinsav-származékok képesek csökkenteni a foszforilált PI3K, AKT és mTOR expressziós szintjét, valamint a downstream effektorok S6 és 4EBP1 foszforilációs szintjét. Bár a dehidroabietinsav különböző származékai bizonyos gátló hatást mutattak a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal fehérjéire, jelenleg nem világos, hogy maga a dehidroabietinsav rendelkezik-e megfelelő gátló képességgel, és további kutatásokra van szükség.

A legtöbb vegyület fehérjemolekulákhoz kötődve fejti ki hatását, és kötődési módjuk és képességeik olyan módszerekkel ellenőrizhetők, mint a fehérjekristály-elemzés és a fehérje fluoreszcencia-csillapítás. A kísérleti időszak azonban hosszú és a költségek magasak. A molekuláris dokkolási technológia a számítógépek segítségével elméleti számításokat végez, és megjósolja a vegyületek és a receptorfehérjék közötti kötődést. A dokkolási kötési energia alapján meghatározható a vegyületek és a fehérjék közötti kötődési képesség, és szűrhetők a potenciális fehérjemodulátorok; a kapott dokkolási konfiguráció és más dokkolási pontszámok segítségével előzetes mechanizmus-kutatás is végezhető. Ezenkívül a vegyületek hatóanyag-tulajdonságainak és farmakokinetikai jellemzőinek, például az emberi szervezetben való felszívódás, eloszlás, anyagcsere, kiválasztás és toxicitás megértése meghatározhatja, hogy felhasználhatók-e a klinikai kezelésre jelölt vegyületekként. A kutatási költségek csökkentése érdekében fokozatosan számítógépes programokat használtak a gyógyszerszerűség és a farmakokinetika előzetes vizsgálatára.

Ezért ebben a tanulmányban molekuláris dokkolási technológiát alkalmaztunk a dehidroabietinsav kötődési képességének és kötődési módjának előrejelzésére az ezen útvonal kulcsfontosságú fehérjéihez, és a dehidroabietinsav tényleges gátlását fehérje immunoblotting segítségével igazoltuk. Továbbá egy hálózati szerver segítségével szimuláltuk a gyógyszerszerű tulajdonságokat és a farmakokinetikát, hogy előzetesen megértsük a dehidroabietinsavnak mint a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal gátlójának potenciálját, és elméleti alapot biztosítsunk a dehidroabietinsav további fejlesztéséhez.

A PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal fontos szerepet játszik a sejtproliferáció, a differenciálódás és az apoptózis folyamatában, és a rákkezelés egyik célpontja is. A PI3K főként a p110 katalitikus alegységből és a p85 szabályozó alegységből áll. Foszforilációs aktiválást követően szubsztrátját, a 3,4-foszfoszfofoszfatidil-inozitolt (PIP2) 3,4,5-trifoszfát foszfatidil-inozittá (PIP3) tudja átalakítani. A PIP3 képes az AKT-hez kötődni és a foszfoinozitol-függő protein kináz 1 (PDK1) révén elősegíteni az AKT foszforilációját. A foszforilációval aktivált AKT közvetlenül vagy közvetve foszforilálhatja az mTOR-t, ezáltal tovább elősegítve a 4EBP1 és S6 downstream effektorfehérjék foszforilációját az intracelluláris biokémiai aktivitás szabályozása érdekében.

Ez a tanulmány a dehidroabietinsav rákellenes származékainak az elmúlt években történt folyamatos fejlesztésén alapul, amelyek közül néhányról azt jelentették, hogy gátló hatással van a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal kulcsfontosságú fehérjéire. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk a dehidroabietinsavnak mint nyersanyagnak a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonalra gyakorolt hatását, és alapot biztosítsunk a dehidroabietinsav rákellenes származékok kifejlesztéséhez. A dehidroabietinsav kötődési képességét és kötődési módját az útvonal kulcsfontosságú PI3K, AKT és mTOR fehérjéinek ATP-kötőhelyeihez molekuláris dokkolási technológia segítségével jósoltuk meg. A dehidroabietinsavnak az útvonalra gyakorolt gátló hatását fehérje immunoblotting segítségével vizsgáltuk, és a dehidroabietinsav orális gyógyszerként való potenciálját előzetes gyógyszerszerű és farmakokinetikai szimulációk segítségével jósoltuk meg.

A molekuláris dokkolási eredmények azt mutatták, hogy a dehidroabietinsav bizonyos kötődési képességgel rendelkezik a különböző kulcsfontosságú fehérjék ATP-kötőhelyeihez, a leggyengébb kötődés az AKT3-hoz -6,16 kcal/mol minimális kötési energiával, a legerősebb kötődés pedig az AKT1-hez -8,04 kcal/mol minimális kötési energiával. A dehidroabietinsav kötődési képessége az útvonalfehérjékhez gyengébb, mint az eredeti ligandumé, mint nagy hatékonyságú inhibitoré, ami hasonló az általunk szintetizált dehidroabietinsav alapú PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal gátló molekulához, a DBDA-hoz. Az ATP-kötőhelyeken a dehidroabietinsav és a fehérjék közötti kölcsönhatási maradékok többnyire hidrofób maradékok. A PI3K δ Lys890 kivételével a többi kulcsfontosságú maradék, amely a ligandumfehérje kötődésében a legfontosabb szerepet játssza, szintén hidrofób maradékok. Ez arra utal, hogy a dehidroabietinsav gátló hatást fejthet ki az ATP-kötőhelyek mirigyes gyrusához való kötődéssel. A különböző fehérjék és a dehidroabietinsav közötti kölcsönhatási maradékok jelentősen átfednek az eredeti liganduméval, ami arra utal, hogy a dehidroabietinsav az ATP-vel az eredeti ligandumhoz hasonló módon versenyezhet a fehérjék hatásának gátlásáért. Ezenkívül a hidrogénkötések nélküli szerkezetek, mint például a dehidroabietinsav és a PI3K α, AKT2 és AKT3 közötti szerkezetek kötési energiája magasabb, mint a hidrogénkötéseket tartalmazó szerkezeteké, ami arra utal, hogy a hidrogénkötések fontos szerepet játszanak a dehidroabietinsav fehérjékhez való stabil kötődésében. A dehidroabietinsav-kötés konfigurációjában minden hidrogénkötés a karboxil-pozícióban jön létre. Az izopropil- és a benzolgyűrű közelében azonban több olyan átfedő maradék van, amelyek az eredeti ligandumban hidrogénkötéseken keresztül lépnek kölcsönhatásba. Ez a tulajdonság arra utal, hogy a dehidroabietinsav alapú PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal új inhibitorainak tervezésekor a karboxil-pozíció hidrofil képessége fokozható, és hidrofil csoportokat lehet bevezetni az izopropil- és a benzolgyűrű pozíciójában, ami javíthatja az új vegyület fehérjékhez való kötődési képességét.

A fehérje immunoblotting kísérletek azt mutatták, hogy a dehidroabietinsavval történő kezelés után a PI3K szabályozott p85 alegység expressziója jelentősen csökkent az SCC9 sejtekben. A p85 tartalom csökkenése akadályozhatja a PI3K generálását, és egyike lehet azoknak a tényezőknek, amelyek csökkentik a PI3K downstream fehérje AKT foszforilációs expresszióját. Az AKT és az mTOR teljes fehérjéje nem mutatott szignifikáns változást a vak csoporthoz képest a dehidroabietinsav különböző koncentrációi alatt, de a foszforilált fehérjék kifejeződése jelentősen csökkent, ami azt jelzi, hogy az AKT és az mTOR foszforilációs folyamata gátolt. A 4EBP1 foszforilációs expressziójának csökkenése az mTOR után annak tudható be, hogy a 4EBP1 a MEK/Erk jelátviteli útvonalon keresztül is aktiválódhat. Az mTOR által szabályozott másik effektor fehérje, az S6K1 downstream foszforilációs expressziója jelentősen csökkent, ami az mTOR foszforilációjának gátlásával magyarázható, ami az S6K1 aktiváció csökkenéséhez és ezáltal az S6 foszforilációs reakciójának mérséklődéséhez vezet. Összességében az SCC9 sejtekben a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal expresszióját gátolta a dehidroabietinsav, ami összhangban van a molekuláris dokkolásban előre jelzett eredményekkel.

A gyógyszer tulajdonságainak és farmakokinetikájának előrejelzésében a dehidroabietinsav Lipinski-ötös szabály szerinti elemzése azt mutatja, hogy a molekulatömeg, a LogP, a rotációs kötés, a hidrogénkötés-akceptor és a hidrogénkötés-donor értékei mind az ezen empirikus szabály által megkövetelt tartományon belül vannak. A farmakokinetikai előrejelzés a dehidroabietinsav felszívódását, eloszlását, metabolizmusát, kiválasztását és toxicitását szimulálja in vivo, és a dehidroabietinsav a legtöbb vizsgálaton megfelelt, ami azt jelzi, hogy in vivo jól kifejtheti gyógyszerhatását.

Összefoglalva, ez a tanulmány megállapította, hogy maga a dehidroabietinsav a PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal gátlására alkalmas terápiás szerré válhat, a tumorsejtek rezisztenciájának és tumorellenes hatásának enyhítése érdekében, molekuláris dokkolási előrejelzés, fehérje immunoblotting kísérletek, gyógyszerhasonlósági vizsgálatok és farmakokinetikai előrejelzés révén. A dehidroabietinsav szerkezetén további módosítások végezhetők a dehidroabietinsav alapú PI3K/AKT/mTOR jelátviteli útvonal hatékonyabb inhibitorainak kifejlesztése érdekében.