Az endofita baktériumok eloszlása és a szteroid szaponin termelő törzsek előzetes szűrése Xiangmaidongban különböző növekedési szakaszokban
A Xiangmaidong, más néven Hubei maidong Liriope spicata var. prolifera Y.T. Ma, a Kínai Népköztársaság gyógyszerkönyvében (2010-es kiadás) a Shanmaidong egyik alapnövénye. Szteroid szaponinok a fő hatóanyaga, és a szapogenin alapváza a spirosztán származékához tartozik (27 szénatomból áll). A spirosztán szerkezetében lévő C25 konfiguráció és az F gyűrű ciklikus állapota szerint a következő négy fő típusra osztható: spirosztanol (C25 S konfiguráció), izoszterosztanol (C25 R konfiguráció) és furosztanol (az F gyűrű nyílt láncú származék).), módosított spirosztanolalkoholok (az F gyűrű egy öt tagú tetrahidrofurángyűrű). Az Ophiopogon japonicusból tizennégyféle szteroid szaponin izoláltak, a fő glikozidok a diosgenin és a ruscogenin, amelyek mindkettő C25 (S) izomer. Közülük a C szaponinok (Ls-S3) tartalma az Ophiopogon japonicusban viszonylag magas. A szteroid szaponinok többféle farmakológiai hatással rendelkeznek, és néhány kémiailag szintetizálható szaponin kivételével ezeket főként közvetlenül a hagyományos kínai gyógyászati anyagokból nyerik kémiai extrakcióval. A Xiangmaidong szteroid szaponinok sem képeznek kivételt. A Xiangmaidong szteroid szaponinok fenntartható termelése és ellátása azonban korlátozott, mivel a hosszú termelési ciklusok, a folyamatos termesztés akadályai, az alacsony szaponin tartalom, a magas extrakciós költségek és a jelentős környezetszennyezés miatt. Ezért új módszereket kell keresni a szaponinok nagy mennyiségben történő előállítására.

Korábban tanulmányok számoltak be olyan endofita baktériumok izolálásáról, amelyek képesek szteroid szaponinokat termelni a Dianzhong és Huazhong épületekből. Ezen felbuzdulva kutatócsoportunk megkísérelte izolálni és felfedezni a Xiangmaidongból származó szteroid szaponinokat metabolizáló és termelő endofita baktériumtörzseket. Tiszta tenyésztési módszerek és 16SrDNS-PCRDGGE technológia segítségével elemeztük és azonosítottuk az endofita baktériumok eloszlását a Xiangmaidong mintáiban (gumók vagy gyökerek) a kezdeti megjelenés, a gyors terjeszkedés és az érett betakarítási időszakok során. Ugyanakkor színreakció, TLC és HPLC módszereket alkalmaztunk a kapott tiszta tenyésztett törzsek szaponintermelő képességének előzetes értékelésére a céltörzsek megszerzése és a szteroid szaponinok "gyári, méretarányos és gyors" termelésének elméleti alátámasztása érdekében.

A hagyományos mikrobiológiai tisztántenyésztési módszerek alkalmazásával ez a tanulmány 15 nemzetséget és 22 endofita baktériumfajt izolált a Xiangmaidong gyökérgumóiból és rostos gyökereiből különböző növekedési szakaszokban. Közülük 4 Bacillus és 4 Staphylococcus faj, 2 Pseudomonas faj, a fennmaradó 12 nemzetség pedig a Salmonella, Enterobacter, Pseudoxanthomonas, Morganella, Agrobacterium, Microbacterium, Porphyromobacter, Acinetobacter, Lysinibacter és Sphingosine volt. A Sphingomonas, a Sphingomonas és a Curtobacterium nemzetségekben csak egy-egy baktériumfaj található.

A 16SrDNS PCR DGGE azonosítása révén ez a tanulmány megállapította, hogy a Xiangmaidong endofita baktériumközösségének szerkezete alapvetően azonos volt a gumók kezdeti megjelenési időszakában, a gyors terjeszkedési időszakban és az érett betakarítási időszakban, és a törzscsoportok között alig volt különbség. Az izolált szekvenciákból a szekvenciák összehangolásával 15 nemzetséget és 21 baktériumfajt azonosítottak, köztük 3 Bacillus és 3 Staphylococcus fajt, 2 Serratia és 2 Pseudomonas fajt, a fennmaradó 11 nemzetséget, köztük a Pseudomonas, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Porphyromobacter, Curtobacterium, Enterobacter, Methylobacterium, nitrogénkötő. Az Azotobacter, Microbacterium és Pseudoclavibacter törzsekből csak egy van. A fent említett 22 tiszta endofita baktériumtörzshöz képest a DGGE 7 új nemzetséget azonosított: Serratia, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Methylobacterium, Azotobacter és Pseudomonas.

Ez a tanulmány értékelte a tisztán termeszthető endofita törzsek szaponintermelő képességét, és előzetesen azonosított három baktériumtörzset, a Pseudoxanthomonas mexicana, a Staphylococcus caprae és a Microbacterium testaceum baktériumtörzseket, amelyek jelentős tulajdonságokkal rendelkeznek a szteroid szaponinok termelésében. A HPLC-detektálás eredményei szerint ez a három endofita baktérium mindegyike jellegzetes csúcsokat mutatott a 15,98, 57,64 és 75,19 perces időpontokban, ami arra utal, hogy legalább három szaponin fermentációs termékükben azonos szerkezetű lehet, ami további kísérleti ellenőrzést igényel. Jelenleg két fő stratégia létezik a szteroid szaponinok kimutatására: az egyik a közvetlen kimutatás, a másik pedig a közvetett kimutatás a hasított szaponinok minőségi és mennyiségi elemzésével. A tudósok HPLC-módszert használtak a dioscin tartalmának meghatározására a Dioscorea nipponica, a nyílgyökér, a szizál és a liliomrügyek esetében. A Xiangmaidong szteroid szaponinok standard és izolált tiszta mintáinak hiánya miatt ebben a kísérletben az elkészített Xiangmaidong gyökér szteroid szaponinokat (keverék) ideiglenesen pozitív kontrollként használták. Azzal, hogy összehasonlítottuk, hogy azonos kimutatási körülmények között azonos időpontban megjelenhetnek-e a jellegzetes csúcsok, előzetesen azonosítottuk az endofita baktériumok glikozidtermelésének jellemzőit. A jövőben laboratóriumunk tovább fogja választani és tisztítani a fermentációs termék szaponin kivonatát, és tömegspektrometriát, nukleáris mágneses rezonanciát és más módszereket fog alkalmazni a pontosabb jellemzéshez.

A 16SrDNS V6 ～ V8 magas változó régiójának DGGE-elemzése alapján, valamint a szteroid szaponinok előállítására képes, tisztán tenyésztett endofita baktériumok szűrési eredményeivel kombinálva ez a kísérlet egy jelenséget talált: a Xiangmaidong gyökérgumóinak gyors terjeszkedési és érett betakarítási időszakában a gyökérgumókból kimutatható a mexikói pseudoyellow pseudomonas P. A gyökérgumókban a mexikói jelenlétét a gyökérgumók kezdeti szakaszában nem mutatták ki. Megerősítést nyert, hogy a Xiangmaidong gyökérgumóinak biomasszája és szteroid szaponin tartalma a kezdeti stádiumtól fokozatosan növekszik, és a betakarítás gyors növekedési és érési szakaszában éri el a csúcspontját. Ez a jelenség arra utal, hogy a mexikói Pseudomonas aeruginosa pozitív korrelációs szerepet játszik a szteroid szaponinok felhalmozódásában az Ophiopogon japonicus gumóiban? Ez is további kísérleti igazolást igényel.