Hat flavonoid egyidejű meghatározása Wuyao levelekben ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás tandem tömegspektrometriával
A Lindera aggregata (Sims) Kosterm, a kámforfélék családjába és a Piper nemzetségbe tartozó növény gyulladáscsökkentő, fájdalomcsillapító, antioxidáns és daganatellenes hatású. Főleg Kína délkeleti, tengerparti tartományaiban termesztik, a leghíresebb a Csöcsiang tartománybeli Tiantai megye, ezért Tiantai Wuyao néven is emlegetik. 2018-ban Zhejiangban az új "Zhejiang nyolc íz" egyikének választották. A modern farmakológiai kutatások kimutatták, hogy a fekete gyógyszer immunmoduláló hatással van a központi idegrendszerre és a szív- és érrendszerre is, így piaci kilátásai széleskörűek. A Wuyao gyógynövény részei azonban lassan nőnek, és gyakran 8-10 évbe telik, mire megfelelnek a minőségi gyógynövény-feldolgozás követelményeinek. A növekedési ciklus során a szár- és levélrészeket gyakran elvetik, ami alacsony erőforrás-felhasználást eredményez. Zhejiang népi területein a Wuyao leveleit gyakran használják akut cellulitis, reumás ízületi gyulladás és más gyulladások kezelésére, és gyakran készítenek belőlük teaitalokat is lipidcsökkentő, májvédő és egyéb egészségügyi előnyökkel járó hatású teákat. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a Wuyao levélkivonatoknak bizonyos lipidcsökkentő hatása van. A kutatócsoport farmakológiai korrelációs vizsgálatot végzett a Wuyao levélkivonatokon, és megállapította, hogy bizonyos hatásmechanizmussal rendelkeznek a hiperlipidémia és a csontritkulás ellen. Ugyanakkor a korai szakaszban szisztematikus kémiai komponensek elkülönítését és extrakcióját is elvégezték a Wuyao leveleken. Hat flavonoidot izoláltak először a Wuyao levelek etanolos kivonatából, amelyeket a következőképpen azonosítottak: D-xilozid (3), kaempferol-3-O - α - L-arabinofuranozid (4), kaempferol-3-O - (2 ″ -3-O-trans-3-O-p-3-O-koumaroil) - α - L-ramnozid (5), kaempferol-3-O - (2 ″, 4 ″ -3-O-di-3-3-O-3-3-O-3-O-di-3-glükozid) O-trans-3-O-p-3-O-coumaroyl) - α - L-ramnosid (6), kémiai szerkezetét az 1. ábra mutatja.

Jelenleg vannak releváns kutatási jelentések a Wuyao levelek minőségének értékeléséről. Yi és munkatársai HPLC-vel határozták meg négy flavonoid tartalmát a Hunan tartományból származó, különböző eredetű Wuyao levelekben. Sun és munkatársai UV-spektrofotometriát használtak a Wuyao levélkivonatok teljes flavonoidtartalmának meghatározására, és megvizsgálták az összes flavonoidok kivonása szempontjából releváns tényezőket az extrakciós folyamat optimalizálása érdekében. Ugyanakkor Sun és munkatársai HPLC-t használtak négy szeszkviterpenoid lakton tartalmának meghatározására a különböző eredetű Wuyao levelekben. Ezek azonban hagyományos kimutatási módszerek, amelyek nem rendelkeznek nagy hatékonysággal és pontossággal a tartalom meghatározásában. A tömegspektrometriás technológia fejlődésével kifejlesztették az ultra nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás tandem tömegspektrometriás technológiát, amely nagy hatékonysággal, nagy specificitással és nagy érzékenységgel rendelkezik. A kromatográfiás tandem tömegspektrometria (UPLC-MS/MS) fontos analitikai módszerré vált a hagyományos kínai gyógyászati anyagok minőségének kimutatására. Ezért ez a tanulmány az UPLC-MS/MS technológiát használja a hat fő flavonoid mennyiségi vizsgálatára a különböző eredetű Wuyao levelekben, és kombinálja az entrópia súly - α - L-közelítő ideális megoldás rangsorolási módszerét (TOPSIS) az elemzéshez és értékeléshez, annak érdekében, hogy tudományos alapot biztosítson a Wuyao levelek belső minőségellenőrzéséhez.

 

Az extrakciós feltételek kiválasztása. Ebben a tanulmányban az UPLC-MS/MS módszert használtuk hat indikátor vegyület, nevezetesen a kaempferol-3-O - α - L-ramnosid (1), a kvercetin (2), a kaempferol-3-O - β - D-xilozid (3) tartalmának egyidejű meghatározására, kaempferol-3-O - α - L-arabinofuranozid (4), kaempferol-3-O - (2"- transz - p-koumaroyl) - α - L-rhamnosid (5) és kaempferol-3-O - (2", 4"- di transz - p-koumaroyl) - α - L-rhamnosid (6), a Wuyao levelekben 10 percen belül. A metanol koncentráció 30%, 50%, illetve 70% volt. A spektrum elemzése alapján a 70% metanolt választották ki a legjobb extrakciós hatás érdekében. Ugyanakkor összehasonlítást végeztünk a fűtési reflux és az ultrahangos extrakciós módszerek között. A tartalmi eredmények alapján a kapott extrakciós arányok összehasonlíthatóak voltak. Az időt és a fogyóeszközköltségeket figyelembe véve az ultrahangos extrakciót fogadták el.
Kromatográfiás tömegspektrometriás körülmények. Ebben a tanulmányban három mozgófázis-rendszert vizsgáltak: acetonitril-víz, acetonitril-0,1% hangyasav-víz és acetonitril-0,1% ammónium-formiát-víz. A megfelelő mobilfázis-rendszer meghatározásához hat flavonoid csúcsterületét és csúcsformáját használtuk értékelési indikátorként. Megállapítottuk, hogy ha mozgófázisnak acetonitrilvizet választottunk, akkor a kaempferol-3-O - (2"- transz-pkumaroil) - α - L-rhamnosid és a kaempferol-3-O - (2", 4"- di-trans-pkumaroil) - α - L-rhamnosid vegyületeknél a farokjelenség jelentkezett; ha acetonitril 0.1% ammónium-formiát vizet választunk mozgófázisnak, a kvercetin-3-O - α - L-arabinofuranozid enyhe csóvát mutat; Amikor mozgófázisnak acetonitril 0,1% hangyasav vizet választottunk, mind a hat vegyület csúcsformája viszonylag szimmetrikus volt. Ezért az acetonitril 0,1% hangyasav-vizet választottuk mobilfázis-rendszernek. A tömegspektrometriás körülmények kiválasztásakor a vizsgálat pozitív és negatív ionmódot használt a hat célvegyület tartalmának meghatározásához. Annak érdekében, hogy a célvegyületek jobb stabilitást, magasabb válaszértékeket és jobb csúcsformákat kapjanak, többször megismételt kísérletek azt mutatták, hogy a negatív ionpásztázási mód használata a detektáláshoz stabilabbá teheti a hat flavonoid vegyületet, jobb csúcsformákkal és válaszértékekkel a detektálási körülmények között. Ugyanakkor a kromatográfia-tömegspektrometriás körülmények vizsgálata során a 2. ábrán látható ionkromatogramból kivont 2. és 5. flavonoidok retenciós ideje alapvetően megegyezett. A hagyományos HPLC-elemzési technikákkal összehasonlítva a tömeg-töltésarány-elemzésen alapuló kromatográfia-tömegspektrometria nem támaszkodik a csúcs-csúcs elválasztásra, és rövid jelgyűjtési idővel és nagy érzékenységgel rendelkezik. Ezért ebben a tanulmányban az UPLC-MS/MS elemzési technológiát használták a hat flavonoid egyidejű meghatározására a Wuyao levelekben, amely több előnnyel jár.
Eredményelemzés. Ez a tanulmány 10 kínai Wuyao termőterületről gyűjtött gyógyászati mintákat, és az UPLC-MS/MS technológiát használta a Wuyao levelek hat kémiai összetevőjének egyidejű meghatározására. A 10 termőterületről származó hat vegyület átfogó elemzésére és értékelésére az entrópiasúlyos TOPSIS-módszert alkalmazták. Az átfogó rangsor a következő volt: Tiantai, Zhejiang>Jinhua, Zhejiang>Changsha, Hunan>Ningde, Fujian>Kunming, Yunnan>Tonglu, Zhejiang>Guilin, Guangxi>Yingtan, Jiangxi. Az eredmények azt mutatták, hogy a Wuyao levelek átfogó minősége Tiantai-ban, Zhejiangban viszonylag magas volt, ami összefügg azzal a hagyományos hiedelemmel, hogy Tiantai, Zhejiang valódi Wuyao gyógyászati anyag termőterület. Ugyanakkor megerősíti a Compendium of Materia Medica feljegyzését is, miszerint a Wuyao esetében Tiantai a győztes; a Dictionary of Traditional Chinese Medicine feljegyzi, hogy a Wuyao termelése a legnagyobb Zhejiangban, és a Tiantai, Zhejiangban előállított termékek minősége a legjobb, ezért "Tiantai Wuyao" vagy "Tai Wuyao" néven emlegetik. Ugyanakkor az értékelési eredmények azt is tükrözik, hogy a különböző eredetű Wuyao levelek hat fő flavonoidjának tartalma között jelentős különbségek vannak, és az ugyanazon tartomány különböző városaiból származó Wuyao levelek között is jelentős különbségek vannak. Ez összefügghet a Wuyao különböző ültetési alapokon és különböző ökológiai környezetben történő bevezetésének forrásaival.
Jelenleg a Wuyao Ye-t új erőforrás-élelmiszerként hagyták jóvá, így a termékfejlesztés tovább folytatódik. Ez a tanulmány egy könnyen kezelhető, jó pontosságú, stabil és megismételhető módszert hozott létre, amely egyszerre hat flavonoid tartalmát képes meghatározni a Wuyao Ye-ban. A módszer használható a Wuyao Ye fő flavonoidjainak mennyiségi elemzésére és átfogó értékelésére, és az alkalmazott entrópiasúlyos TOPSIS-módszer elméleti alapot nyújt más gyógynövények minőségének értékeléséhez is, amelyek gyógyászati értékkel bírnak.