Distribución de bacterias endofíticas y cribado preliminar de cepas productoras de saponinas esteroideas en Xiangmaidong en diferentes fases de crecimiento
Xiangmaidong, también conocida como Hubei maidong Liriope spicata var. prolifera Y.T. Ma, es una de las plantas fuente de Shanmaidong en la Farmacopea de la República Popular China (edición de 2010). Las saponinas esteroides son su principal ingrediente activo, y su esqueleto básico de sapogenina pertenece al derivado del espirostano (compuesto por 27 átomos de carbono). Según la configuración C25 en la estructura del espirostano y el estado cíclico del anillo F, puede dividirse en los cuatro tipos principales siguientes: espirostanol (C25 es configuración S), isosterostanol (C25 es configuración R) y furostanol (el anillo F es un derivado de cadena abierta), alcoholes de espirostanol modificados (el anillo F es un anillo de tetrahidrofurano de cinco miembros). Se han aislado catorce tipos de saponinas esteroideas de Ophiopogon japonicus, siendo los principales glucósidos la diosgenina y la ruscogenina, ambos isómeros C25 (S). Entre ellos, el contenido de saponinas C (Ls-S3) en Ophiopogon japonicus es relativamente alto. Las saponinas esteroideas tienen múltiples actividades farmacológicas y, a excepción de unas pocas que pueden sintetizarse químicamente, se obtienen sobre todo directamente de materiales medicinales chinos tradicionales mediante extracción química. Las saponinas esteroides de Xiangmaidong no son una excepción. Sin embargo, debido a problemas como los largos ciclos de producción, los continuos obstáculos de cultivo en el campo, el bajo contenido en saponinas, los elevados costes de extracción y la importante contaminación ambiental, la producción y el suministro sostenibles de saponinas esteroideas de Xiangmaidong se ven limitados. Por lo tanto, es necesario buscar nuevas formas de preparar saponinas en grandes cantidades.

Anteriormente, había estudios que informaban del aislamiento de bacterias endofíticas capaces de producir saponinas esteroideas de los edificios Dianzhong y Huazhong. Inspirado por esto, nuestro equipo de investigación intentó aislar y descubrir cepas bacterianas endofíticas que metabolizan y producen saponinas esteroideas de Xiangmaidong. Utilizando métodos de cultivo puro y la tecnología 16SrDNA-PCRDGGE, analizamos e identificamos la distribución de bacterias endofíticas en muestras (tubérculos o raíces) de Xiangmaidong durante su aparición inicial, rápida expansión y periodos maduros de recolección. Al mismo tiempo, se utilizaron métodos de reacción de color, TLC y HPLC para evaluar preliminarmente la capacidad de producción de saponinas de las cepas de cultivo puras obtenidas, con el fin de obtener las cepas objetivo y proporcionar apoyo teórico para la producción "en fábrica, a escala y rápida" de saponinas esteroideas.

Utilizando métodos tradicionales de cultivo microbiano puro, en este estudio se aislaron 15 géneros y 22 especies de bacterias endofíticas de los tubérculos radiculares y las raíces fibrosas de Xiangmaidong en diferentes fases de crecimiento. Entre ellos, había 4 especies de Bacillus y 4 especies de Staphylococcus, 2 especies de Pseudomonas, y los 12 géneros restantes, incluyendo Salmonella, Enterobacter, Pseudoxanthomonas, Morganella, Agrobacterium, Microbacterium, Porphyromobacter, Acinetobacter, Lysinibacter, y Sphingosine. Sólo hay una especie de bacterias en los géneros Sphingomonas, Sphingomonas y Curtobacterium.

A través de la identificación DGGE 16SrDNA PCR, este estudio encontró que la estructura de la comunidad bacteriana endófita de Xiangmaidong era básicamente la misma durante el período de aparición inicial, el período de rápida expansión y el período de cosecha madura de sus tubérculos, con poca diferencia en los grupos de cepas. A través de la alineación de secuencias, se identificaron 15 géneros y 21 especies de bacterias a partir de las secuencias aisladas, incluyendo 3 especies de Bacillus y 3 especies de Staphylococcus, 2 especies de Serratia y 2 especies de Pseudomonas, y los 11 géneros restantes, incluyendo Pseudomonas, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Porphyromobacter, Curtobacterium, Enterobacter, Methylobacterium, fijadoras de nitrógeno. Sólo hay una cepa de Azotobacter, Microbacterium y Pseudoclavibacter. En comparación con las 22 cepas de bacterias endofíticas puras mencionadas anteriormente, DGGE ha identificado 7 nuevos géneros: Serratia, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Methylobacterium, Azotobacter y Pseudomonas.

Este estudio evaluó la capacidad de producción de saponinas de cepas endofíticas cultivables puras e identificó de forma preliminar tres cepas de bacterias, Pseudoxanthomonas mexicana, Staphylococcus caprae y Microbacterium testaceum, con características significativas de producción de saponinas esteroideas. Según los resultados de la detección por HPLC, estas tres bacterias endofíticas mostraron picos característicos en los puntos temporales de 15,98, 57,64 y 75,19 minutos, lo que indica que al menos tres saponinas de sus productos de fermentación pueden tener la misma estructura, lo que requiere una mayor verificación experimental. En la actualidad, existen dos estrategias principales para detectar las saponinas esteroideas: una es la detección directa, y la otra es la detección indirecta a través del análisis cualitativo y cuantitativo de las saponinas escindidas. Los estudiosos han utilizado el método HPLC para determinar el contenido de dioscina en Dioscorea nipponica, arrurruz, sisal y yemas de lirio. Debido a la falta de muestras puras estándar y aisladas de saponinas esteroideas de Xiangmaidong en este experimento, las saponinas esteroideas de raíz de Xiangmaidong preparadas (mezcla) se utilizaron temporalmente como controles positivos. Comparando si podían aparecer picos característicos en el mismo punto temporal bajo las mismas condiciones de detección, se identificaron preliminarmente las características de producción de glucósidos de las bacterias endofíticas. En el futuro, nuestro laboratorio seguirá separando y purificando el extracto de saponina del producto de fermentación, y utilizará la espectrometría de masas, la resonancia magnética nuclear y otros métodos para una caracterización más precisa.

Basado en el análisis DGGE de la región variable alta de 16SrDNA V6 ～ V8, y combinado con los resultados de la selección de bacterias endofíticas puras cultivadas capaces de producir saponinas esteroidales, este experimento encontró un fenómeno: durante el período de expansión rápida y el período de madurez de la cosecha de los tubérculos de raíz de Xiangmaidong, se puede detectar pseudomonas mexicana P. de sus tubérculos de raíz La presencia de mexicana no se detectó en la etapa inicial de los tubérculos de raíz. Se ha confirmado que la biomasa y el contenido de saponinas esteroidales en los tubérculos de raíz de Xiangmaidong aumentan gradualmente desde la etapa inicial y alcanzan su punto máximo durante las etapas de rápida expansión y madurez de la cosecha. ¿Implica este fenómeno que Pseudomonas aeruginosa en México juega un papel positivamente correlacionado en la acumulación de saponinas esteroidales en los tubérculos de Ophiopogon japonicus? Esto también requiere una verificación experimental adicional.