Estudio preliminar sobre el efecto protector de la icariina activando la vía de señalización Nrf2 contra la lesión inducida por D-galactosa en células Sertoli 15P-1 testiculares de ratón.
Con el continuo desarrollo de la economía y la sociedad y la creciente presión sobre la supervivencia de las personas, la infertilidad se ha convertido en un problema mundial. Las investigaciones han descubierto que alrededor de 15% de las parejas de todo el mundo sufren infertilidad, siendo los factores masculinos responsables de alrededor de 50%, y el mecanismo aún no se conoce del todo. Las células de Sertoli testiculares, como únicas células somáticas conectadas a las células espermatogénicas, rodean estructuralmente a las células madre espermatogonias, a las espermatogonias y a varios niveles de células espermatogénicas, formando una barrera testicular sanguínea a través de varias proteínas de unión hermética como la Occludina y la Claudina-1. Las investigaciones han demostrado que las células de sostén testicular segregan diversos factores de crecimiento, como el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), la proteína morfogenética ósea-4 (BMP4) y el factor de células madre (SCF), que regulan la proliferación y diferenciación de las células madre espermatogonias y favorecen la formación de espermatozoides. En otro estudio se observó que las ratas macho expuestas al cromo hexavalente durante el embarazo mostraban una regulación a la baja de la expresión de las proteínas de unión estrecha Occludin y Claudin-1 en las células de sostén después de la edad adulta, lo que provocaba un aumento de la apoptosis de las células espermatogénicas y un deterioro de la producción de esperma. Bajo estimulación por estrés térmico, las células de Sertoli testiculares bovinas se dañan, y los niveles de ARNm de GDNF y SCF se regulan a la baja, lo que conduce a la disfunción espermática. Por tanto, mejorar la estructura y función de las células de sostén puede ser una nueva vía para tratar la infertilidad masculina.

El epimedio es una hierba medicinal tradicional china con propiedades nutritivas, registrada por primera vez en el "Shennong Bencao Jing". Tonifica el yang del riñón, fortalece los músculos y los huesos y disipa el viento y la humedad. La investigación farmacológica moderna ha demostrado que el Epimedium tiene efectos significativos en el retraso del envejecimiento y la mejora de la función reproductora masculina. Su principal ingrediente activo es la icariina (ICA). Los estudios han descubierto que el ICA puede promover la proliferación de células de Sertoli primarias en ratas y mejorar la función de las células de Sertoli masculinas. Las investigaciones han demostrado que el ICA puede mejorar la función reproductora de las ratas al aumentar los niveles de expresión del ARNm de los receptores de la hormona folículo estimulante y de la proteína de unión estrecha Claudin-11 en las células de sostén, mejorando así la resistencia al estrés antioxidante del tejido testicular. El factor nuclear eritroide como 2 (Nrf2), como principal regulador del sistema de defensa celular del organismo, regula la expresión de una serie de genes que codifican proteínas antioxidantes y proteínas de respuesta al estrés oxidativo mediante la unión a secuencias potenciadoras en la región reguladora promotora de elementos de respuesta antioxidante (ARE), coordinando respuestas de ajuste fino a diversas condiciones de estrés y ataques dañinos, y logrando la homeostasis del microambiente celular. Las investigaciones han descubierto que el Epimedium puede aliviar el daño hepático inducido por el estrés oxidativo mediante la activación de Nrf2. Nuestra investigación anterior descubrió que el ICA puede aliviar el daño del ADN en las células germinales testiculares de ratas que envejecen naturalmente mediante la regulación de Nrf2. El ICA puede aumentar la expresión proteica de las proteínas Occludin y Claudin-1, relacionadas con las uniones estrechas, en la línea celular TM4 de soporte testicular de ratón inducida por D-Gal. Sin embargo, actualmente no existe ningún informe de investigación sobre si el ICA puede mejorar el daño celular 15P-1 inducido por D-Gal a través de la vía de señalización Nrf2. Estudios anteriores han demostrado que D-Gal puede inducir daños en la unión estrecha en las células TM4 de la línea celular de soporte testicular de ratón. Por lo tanto, este experimento utilizó células 15P-1 inducidas por D-galactosa (D-Gal) como modelo de daño para explorar el efecto protector y el mecanismo de ICA en el daño de las células de Sertoli a partir de la vía de señalización Nrf2.

En los últimos años, la OMS ha reconocido la infertilidad como un problema de salud pública. La tasa de incidencia de la infertilidad en la población general ha aumentado año tras año, afectando a cerca de 15% de las parejas en edad fértil en el mundo. Las investigaciones muestran que en Estados Unidos y otros países occidentales el recuento de espermatozoides disminuye en 1,5% anualmente, y se calcula que cerca de 70 millones de parejas en todo el mundo han sido víctimas de la infertilidad o la esterilidad. Una encuesta epidemiológica a gran escala realizada por la OMS descubrió que aproximadamente la mitad de la infertilidad de las parejas está causada por factores masculinos, y el mecanismo aún no se conoce del todo.

Las investigaciones han descubierto que D-Gal puede reducir el número y la función de las células TM4 de la línea celular de sostén del ratón. Por lo tanto, elegimos el modelo D-Gal para evaluar si ICA puede aliviar el daño celular 15P-1. Hay informes de la literatura que después del tratamiento con 35, 70, y 140 μ M ICA en células endoteliales ECV-304, la tasa de inhibición celular fue 1,2% y no hubo citotoxicidad significativa. Los resultados de MTT de este experimento mostraron que en comparación con el grupo de control, cuando ICA se utilizó solo para tratar las células 15P-1, el IC50 fue mayor que 50% a una concentración de 40 μ M, lo que indica que ICA no tenía citotoxicidad significativa. Nuestra investigación preliminar encontró que ICA tiene un efecto protector sobre el daño celular TM4 tratados con D-Gal, y tiene un efecto proliferativo significativo en concentraciones de 0,5 y 1 μ M. Los resultados de MTT de este experimento también mostró que en comparación con el grupo de tratamiento D-Gal, ICA aumentó la tasa de supervivencia celular de una manera dependiente de la concentración en 0,125-1 μ M, y tuvo un efecto promotor significativo sobre la proliferación celular en concentraciones de 0..5 y 1 μ M. El efecto promotor de la ACI se debilitó cuando la concentración fue mayor que 1 μ M, que puede ser debido a la mayor duración de la estimulación de D-Gal en 15P-1 células en este experimento, el daño celular más grave, y en gran medida el aumento de la sensibilidad de las células dañadas a la estimulación de drogas, mostrando así un fenómeno de promoción de baja concentración y la inhibición de alta concentración. Las células de Sertoli testiculares son células somáticas localizadas en los túbulos seminíferos de los testículos que están directamente conectadas con las células espermatogénicas. Regulan la proliferación y diferenciación de las células madre espermatogonias y promueven la formación de espermatozoides mediante la secreción de diversas citoquinas como GDNF, BMP4 y SCF. El GDNF es un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta y un factor importante en la regulación de la proliferación de las células madre espermatogonias. Desempeña un papel crucial en el desarrollo de las células reproductoras masculinas y en el desarrollo testicular temprano. BMP4 y SCF son factores importantes que promueven la diferenciación de las células madre espermatogonias. Investigaciones anteriores de nuestro grupo de investigación han demostrado que los flavonoides totales de Epimedium pueden aumentar los niveles de ARNm y proteínas de GDNF, BMP4 y SCF secretados por las células de Sertoli en testículos de ratas que envejecen naturalmente, mejorando la función de secreción de las células de Sertoli. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo de control, los niveles de expresión de ARNm y proteína de los factores secretados por las células de Sertoli disminuyeron significativamente tras el tratamiento con D-Gal, mientras que los niveles de expresión de ARNm y proteína de los factores secretados por las células de Sertoli aumentaron significativamente en 15P-1 tras el tratamiento con ICA. El ICA puede mejorar la función secretora de las células de Sertoli testiculares 15P-1.

Las uniones estrechas entre las células de sostén son el componente más importante de la barrera testicular sanguínea, e incluyen principalmente las tres familias de proteínas transmembrana de Occludina, Claudina y proteínas de adhesión, así como la familia de proteínas citoplasmáticas de la unión de bloqueo. Las uniones estrechas entre células no sólo protegen a las células reproductoras de la invasión del sistema inmunitario y proporcionan un buen entorno fisiológico para la espermatogénesis, sino que también permiten que los espermatocitos pre-finos y post-finos atraviesen regularmente la barrera testicular sanguínea para su posterior desarrollo. Las investigaciones han descubierto que la occludina y la claudina son las primeras proteínas de membrana de unión estrecha identificadas, y que la capacidad de unión estrecha y la función de barrera epitelial están mediadas principalmente por la claudina. Otro estudio ha demostrado que la inyección de un péptido sintético de Occludina en testículos de rata puede eliminar de forma reversible la mayoría de las espermatogonias al cabo de 27 días, mientras que la eliminación de Occludina in vitro también puede provocar una disminución de la función de unión estrecha de las células de sostén. Los resultados de este experimento mostraron que, en comparación con el grupo de control, la expresión de la proteína de la unión estrecha en las células 15P-1 disminuyó tras el tratamiento con D-Gal, mientras que la expresión de la proteína de la unión estrecha en las células de soporte 15P-1 aumentó significativamente tras el tratamiento con ICA. El ICA tiene un efecto protector sobre el daño de la proteína de la unión estrecha en las células 15P-1 de soporte.

Cuando el organismo se encuentra en un estado normal, la proteína Kelch like ECH associated protein-1 (Keap1) recluta a Nrf2 y forma un complejo en el citoplasma que es degradado por la proteasa ubiquitina; cuando se produce estrés oxidativo, Nrf2 se disocia de Keap1, y Nrf2 se traslada del citoplasma al núcleo para unirse a ARE, activando la transcripción de genes protectores corriente abajo como HO-1 y NQO1, resistiendo así el daño por estrés oxidativo causado por diversos estímulos al organismo. Nuestras investigaciones anteriores han demostrado que el ICA puede aliviar el daño testicular del ADN en ratas que envejecen de forma natural y mejorar el declive de la función reproductiva causado por el envejecimiento mediante la activación de la vía de señalización Nrf2/HO-1. Esto sugiere que la mejora de la disfunción espermatogénica por ICA puede estar relacionada con la vía de señalización Nrf2. Estudios anteriores han demostrado que la ACI puede mejorar el daño celular TM4 inducido por D-Gal en la línea celular de soporte testicular. Por lo tanto, este estudio utilizó Western blot para detectar proteínas de la vía Nrf2. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo de control, los niveles de expresión de importantes proteínas de la vía Nrf2, HO-1 y NQO-1 en las células 15P-1 se redujeron significativamente tras la estimulación con D-Gal, mientras que aumentaron significativamente tras la administración de ICA. Posteriormente, detectamos la expresión y localización de Nrf2 mediante inmunofluorescencia. En comparación con el grupo de control normal, la expresión de fluorescencia de Nrf2 en el núcleo de las células 15P-1 en el grupo de tratamiento D-Gal se debilitó, pero mejoró después del tratamiento ICA. Los resultados anteriores sugieren que el daño funcional y estructural de las células 15P-1 está relacionado con la regulación a la baja de la vía de señalización Nrf2, que conduce a una disminución de la capacidad antioxidante celular. El ICA puede mejorar el daño de las células 15P-1 aumentando su capacidad antioxidante.

En resumen, el ACI puede aumentar los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con la secreción GDNF, BMP4, SCF, así como las proteínas relacionadas con la unión estrecha Occludin y Claudin-1 en las células 15P-1 mediante la activación de la vía de señalización Nrf2, mejorando así el daño inducido por D-Gal en las células 15P-1. Este experimento ha sentado las bases teóricas de nuestra investigación posterior sobre el efecto protector y el mecanismo del ACI en las células germinales. Este experimento ha sentado las bases teóricas para nuestra investigación posterior sobre el efecto protector y el mecanismo de ICA en las células germinales, con el fin de explorar mejor el valor de aplicación de la medicina herbal china Epimedium en el sistema reproductivo, y proporcionar nuevas direcciones para el tratamiento clínico de la infertilidad masculina.