El polisacárido GiP-B1 de Glycyrrhiza uralensis activa los macrófagos RAW264.7 a través de la vía de señalización TLR4/MyD88/NF - κ B
El sistema inmunitario innato es una importante línea de defensa del organismo para resistir la invasión de patógenos, y los receptores tipo Toll (TLR), así como las células presentadoras de antígenos como los macrófagos y las células dendríticas que expresan TLR, son componentes importantes del sistema inmunitario innato. Las investigaciones sobre la implicación de los TLR en el reconocimiento inmunitario de los macrófagos, la regulación de la transducción de señales y el inicio de la respuesta inmunitaria han demostrado que todos los miembros de la familia TLR, excepto TLR3, pueden reconocer ligandos como los lipopolisacáridos (LPS), unirse al factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88), reclutar quinasas relevantes, y activar la quinasa inhibidora del factor nuclear kappa B (IKK), que fosforila el inhibidor de NF - κ B (I κ B) que se une a NF - κ B. Y se disocia, activa NF - κ B en el núcleo, iniciar o inhibir la transcripción de genes diana, regulando así la respuesta inmune innata.
Los polisacáridos, como clase eficaz de reguladores de la respuesta biológica, activan las respuestas inmunitarias de los macrófagos mediante mecanismos relacionados con la transducción de la vía de señalización TLRs/NF - κ B. La investigación ha descubierto que muchos polisacáridos vegetales pueden unirse específicamente a receptores como TLR2/4 en la superficie de los macrófagos, activar la vía de señalización NF - κ B, regular la transcripción de citocinas y la expresión de moléculas coestimuladoras en las células fagocíticas, e iniciar cascadas descendentes para activar la inmunidad innata y adquirida.
Glycyrrhiza inflata Bat. es un recurso vegetal medicinal característico de Xinjiang. Sus raíces y rizomas secos se han incluido en la farmacopea china como hierbas medicinales. Nuestro grupo de investigación ha confirmado que su polisacárido GiP crudo y sus componentes purificados promueven la proliferación de macrófagos y linfocitos. El componente purificado GiP-B1, que tiene un alto contenido, es un polisacárido ácido con una cadena principal poli Rha GalA, con un peso molecular relativo superior a 2,0 × 106Da y un contenido de ácido urónico de 16,8%. Puede promover significativamente la proliferación y la fagocitosis de los macrófagos RAW264.7, aumentar la secreción de IL-1 β y TNF - α por los macrófagos, y promover la generación de NO y NOS. El equipo de investigación utilizó además un anticuerpo monoclonal anti-TLR4 para intervenir en los macrófagos y descubrió que la secreción de TNF - α, IL-1 β, 1L-6, y NO inducida por GiP-B1, así como la expresión de iNOS, 1L-1 β, TNF - α, y 1L-6 ARNm, se inhibieron en diversos grados, lo que sugiere que la activación de los macrófagos por GiP-B1 puede estar relacionada con TLR4 y sus vías de señalización relacionadas. Con el fin de investigar la relación entre los macrófagos activados por GiP-B1 y la vía de señalización TLR4/NF - κ B, en este estudio se transfectaron macrófagos RAW264.7 con ARN interferente TLR4 (ARNsi TLR4) in vitro para explorar si la intervención de GiP-B1 puede activar los macrófagos a través de la vía de señalización NF - κ B mediada por TLR4, con el fin de dilucidar el mecanismo molecular de los macrófagos activados por GiP-B1.

Los macrófagos son importantes ejecutores de la inmunidad innata en el organismo. Como células fagocíticas tisulares especializadas, pueden reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) conservados en la superficie de microorganismos patógenos a través de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) como los TLR expresados en su superficie. A través de vías de señalización descendentes, regulan la expresión de varios genes de respuesta inmunitaria para eliminar los patógenos. La investigación ha demostrado que muchos polisacáridos de plantas naturales pueden servir como ligandos para TLR4, facilitando la señalización de macrófagos a través de vías dependientes y no dependientes de MyD88, promoviendo la entrada de NF - κ B en el núcleo y la unión a secuencias de reconocimiento específicas en promotores de ADN, mediando la expresión de citoquinas como IL-1, IL-6, TNF - α, etc. Estas citoquinas también actúan como estimuladores de NF - κ B, activando aún más NF - κ B para causar respuestas inflamatorias sostenidas y activar respuestas inmunes adaptativas.
Como planta fuente del regaliz de la medicina tradicional china, las principales sustancias medicinales del regaliz de fruto hinchado incluyen no sólo chalconas con actividad anticancerígena, sino también polisacáridos con actividad antioxidante, inhibidora de la alfa glucosidasa y reguladora inmunológica. En la investigación preliminar de nuestro grupo de investigación, se descubrió que el polisacárido crudo GiP y sus componentes purificados de Glycyrrhiza uralensis tienen el efecto de promover la proliferación de macrófagos y linfocitos. Entre ellos, el componente purificado GiP-B1 con mayor contenido tiene un efecto promotor significativo sobre la proliferación, la fagocitosis y la secreción de citocinas de los macrófagos RAW264.7. El grupo de investigación preliminar utilizó anti-TLR4 para tratar las células y descubrió que su mecanismo de acción está relacionado con la activación de la vía de señalización TLR4/NF - κ B tras la intervención de la muestra. Este artículo utiliza la tecnología de siRNA para silenciar el gen TLR4 a través de TLR4 siRNA, y encuentra que GiP-B1 promueve la proliferación de macrófagos RAW264.7 e inhibe la secreción de citoquinas TNF - α, IL-1 β, y IL-6. Esto indica que TLR4 está implicado en el efecto de GiP-B1 sobre la proliferación de macrófagos RAW264.7 y la secreción de citocinas, es decir, la activación de macrófagos por GiP-B1 está relacionada con TLR4, lo que concuerda con los resultados de experimentos previos de bloqueo con anticuerpos. Además, sobre la base de los tipos de citocinas secretadas por los macrófagos activados por GiP-B1 a través de TLR4, como TNF - α, IL-1 β, IL-6, etc., sugiere que la activación GiP-B1 de los macrófagos puede inducir la polarización hacia el tipo M1. Los macrófagos de tipo M1 no sólo promueven respuestas inflamatorias, sino que también tienen capacidades de presentación de antígenos, que pueden activar respuestas inmunitarias adaptativas de células T, inducir respuestas inmunitarias de células Th1 y ejercer funciones de limpieza inmunitaria del huésped contra patógenos y células tumorales. Estudios anteriores también han descubierto que GiP-B1 tiene ciertos efectos antitumorales in vitro. Queda por determinar si su mecanismo de acción está relacionado con el hecho de que GiP-B1 promueve la polarización de los macrófagos y si puede promover la función inmunitaria antitumoral del organismo mediante la regulación de los macrófagos en el microentorno tumoral.
Con el fin de seguir demostrando la relación entre la activación GiP-B1 de los macrófagos y la vía TLR4/NF - κ B, este experimento también estudió los cambios de expresión de ARNm y proteínas de los genes reguladores aguas arriba TLR4, la molécula dependiente MyD88, los genes receptores aguas abajo NF κ Bp65, I κ B α, etc. en macrófagos regulados por GiP-B1 bajo la intervención TLR4 siRNA. Los resultados mostraron que debido al silenciamiento del gen TLR4, el nivel de expresión del ARNm TLR4 disminuyó, el contenido de NF - κ Bp65 libre en el núcleo disminuyó significativamente, y la activación de la vía NF - κ B también disminuyó en consecuencia; GiP-B1 no sólo aumenta la expresión del gen TLR4 en macrófagos en condiciones normales, regula al alza el ARNm y la expresión de proteínas de TLR4 señalización dependiente molécula MyD88 y los genes aguas abajo NF - κ Bp65 y p-I κ B α, sino que también regula al alza el ARNm y la expresión de proteínas de TLR4 y MyD88, NF - κ Bp65 y p-I κ B α causada por la interferencia de ARN, lo que demuestra que GiP-B1 puede actuar como uno de los ligandos TLR4, activar la vía de señalización TLR4/NF - κ B dependiente de MyD88, activar el factor de transcripción nuclear p65 en la familia NF - κ B, lo que lleva a la degradación de la fosforilación de I κ B y la disociación de NF - κ B, y promover NF - κ B. Transfiriéndose del citoplasma al núcleo, uniéndose a secuencias específicas de ADN, regulando la transcripción de citoquinas inflamatorias, proliferación celular (antiapoptosis) y otros genes, participando en respuestas inflamatorias, respuestas inmunes, etc. GiP-B1 activa los macrófagos a través de la vía de señalización TLR4/MyD88/NF - κ B, que es casi idéntica a la vía de acción de los polisacáridos en los estudios antes mencionados.
En resumen, GiP-B1 puede regular la función inmunitaria de los macrófagos RAW264.7 a través de la vía de señalización TLR4/NF - κ B, y su efecto regulador se consigue principalmente a través de la vía dependiente de MyD88. Este experimento proporciona evidencia experimental de la activación de los macrófagos por polisacáridos Glycyrrhiza uralensis, que ayuda a dilucidar el mecanismo de acción de polisacáridos Glycyrrhiza uralensis en la respuesta inflamatoria, la respuesta inmune, y otros aspectos.