Efecto protector de los oligosacáridos de quitosano en ratones con colitis inducida por sulfato de dextrano
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) incluye la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). La colitis ulcerosa fue descubierta por Wilk y Moxon en 1875, definida por Boas y Wilk en 1903 y designada oficialmente como enfermedad clínica especial por la OMS en 1905. La colitis ulcerosa es una colitis inespecífica localizada principalmente en el colon sigmoide y el recto del intestino grueso. Las lesiones se distribuyen de forma continua en la mucosa y la submucosa, y recidivan lentamente. También hay algunos casos de aparición aguda, que se manifiestan principalmente como dolor abdominal, diarrea y heces pegajosas con pus y sangre, acompañados de diversos síntomas extraintestinales. La etiología y patogénesis exactas de la colitis ulcerosa aún no están claras, y en general se cree que están relacionadas con diversos factores como infecciones, trastornos del sistema inmunitario, sensibilidad genética, medio ambiente, estado mental y disbiosis. Es muy frecuente en los países occidentales, donde la padecen entre 10 y 20 personas por cada 105, y la tasa de incidencia en Norteamérica y Europa Occidental es mayor. En los últimos años, la incidencia de la CU en China también ha ido en aumento. En la actualidad, existen fármacos sintomáticos como el ácido 5-aminosalicílico (sulfasalazina) e inmunosupresores para el tratamiento de la colitis, pero tienen ciertos efectos secundarios, por lo que la búsqueda de fármacos seguros es un punto caliente de la investigación.
Los quitooligosacáridos (COS) se producen por hidrólisis del quitosano (CS), con un grado de polimerización de 2-20 y un peso molecular medio inferior a 3900 Da. Su peso molecular es pequeño, fácilmente soluble en agua y puede ser absorbido directamente por los organismos biológicos. Tiene actividades biológicas como la reducción de grasas, la disminución del azúcar en sangre, la inhibición de bacterias, la lucha contra el cáncer y la antiinflamación, y no tiene efectos secundarios tóxicos. Puede utilizarse ampliamente en diversos campos como la medicina, la cosmética, la alimentación y la agricultura. El quitosano puede obtenerse por desacetilación de la quitina, el segundo polímero más abundante del mundo después de la celulosa (que se encuentra comúnmente en el caparazón de los crustáceos, la epidermis de los insectos y las paredes celulares de los hongos). En la actualidad, se han realizado algunos estudios sobre el efecto de los oligosacáridos de quitosano en la colitis, como el descubrimiento de Yang et al. de que los oligosacáridos de quitosano pueden lograr efectos protectores en la colitis a través de AMPK y NF - κ B. Sin embargo, la concentración de aplicación es significativamente mayor (por lo general 500 mg / kg, equivalente a una dosis humana de alrededor de 3,6 g), superando con creces la dosis de ingesta recomendada nacional de 0,5 g / día (ver Anuncio sobre la aprobación de seis nuevos ingredientes alimentarios incluyendo oligosacáridos de quitosano (2014 N º 6), equivalente a una dosis de ratón de 70 mg / kg). Yousef descubrió que los oligosacáridos de quitosano a una dosis de 20 mg/kg también pueden tener un efecto protector sobre la colitis utilizando el modelo de colitis por infusión de ácido acético y experimentos con células epiteliales intestinales. Por lo tanto, este artículo utiliza principalmente un modelo de ratón de colitis inducida por agua potable DSS 3% para verificar la intervención de los oligosacáridos de quitosano en la colitis a diferentes dosis (70 y 140 mg/kg), explorar el papel de los oligosacáridos de quitosano en la regulación de los síntomas de colitis y el estado fisiológico en ratones, y proporcionar datos de apoyo para futuras investigaciones sobre el efecto protector de los oligosacáridos de quitosano en ratones con colitis inducida por DSS. En este experimento, 50 ratones machos C57BL/6 se dividieron aleatoriamente en 5 grupos: grupo en blanco, grupo modelo, grupo positivo (SASP, 50 mg/kg), y grupos de dosis bajas y altas de quitosano (70 y 140 mg/kg) bebiendo agua que contenía 3% sulfato de dextrano sódico (DSS) durante 7 días para establecer un modelo. Evaluar el efecto de los quitooligosacáridos mediante cambios de peso, índice de actividad de la enfermedad, puntuación patológica y actividad mieloperoxidasa. Detectar los niveles de factores inflamatorios en la colitis mediante ELISA.

El modelo de colitis DSS es un modelo animal experimental de CU internacionalmente reconocido y ampliamente utilizado, establecido en 1990. Sus cambios patológicos incluyen la formación de úlceras, absceso de criptas, inflamación de vasos pequeños, disminución de células caliciformes e infiltración de diversas células inflamatorias, que son similares a los síntomas clínicos de la colitis humana. La dosis humana de quitosano recomendada por el país es de 0,5 g/persona, lo que se convierte en una dosis para ratones de 70 mg/kg. Por lo tanto, utilizando este modelo, seleccionamos dos dosis de quitosano, 70 mg/kg y 140 mg/kg, para investigar sus efectos de intervención en la colitis inducida por DSS. Una bibliografía coreana realizó experimentos de toxicidad aguda con oligosacáridos y descubrió que la DL50 de oligosacáridos en ratones superaba los 5,0 g/kg. La evaluación de la seguridad de los alimentos funcionales con quitosano realizada por Zhao et al. demostró que no se observaron reacciones tóxicas agudas en los 10 días siguientes a su administración a ratones (1,25 g/kg/día) y ratas (1,47 g/kg/día) (aproximadamente 312-368 veces la dosis recomendada clínicamente). Este experimento estableció un modelo de colitis ulcerosa permitiendo que los ratones bebieran libremente 3% DSS durante 7 días. Al sexto día del experimento, se observaron síntomas fisiológicos típicos de colitis en los ratones del grupo modelo, como pérdida de peso, pérdida de apetito, pelo desigual, diarrea, heces pegajosas con sangre e incluso hemorragia rectal. Al octavo día de la disección, se observó que el colon de los ratones del grupo modelo estaba acortado y que el tejido del colon estaba congestionado y edematoso. La tinción HE reveló edema de la mucosa del colon, células epiteliales incompletas, desaparición de la estructura glandular de la cripta y un grave infiltrado inflamatorio. Los síntomas mencionados mejoraron en los ratones tratados con dosis bajas (70 mg/kg) y altas (140 mg/kg) de quitosano. En consonancia con los resultados de Yousef et al., señaló que los oligosacáridos de quitosano pueden reducir la apoptosis de las células epiteliales intestinales, inhibir la inflamación y proteger la integridad estructural y funcional de la barrera epitelial intestinal. Algunos estudios sugieren que la enfermedad inflamatoria intestinal está causada por defectos en la barrera epitelial intestinal y la desregulación de la respuesta inmunitaria de la mucosa. Los oligosacáridos de quitosano pueden proteger las células epiteliales intestinales, lo que indica su importante papel protector en la enteritis. En este experimento, el grupo de dosis de 70 mg/kg de quitosano mostró diferencias significativas respecto al grupo modelo en la mejora del acortamiento del colon, el alivio del edema de la mucosa colónica y la protección de las células caliciformes y las estructuras de las criptas. Sin embargo, el grupo de dosis de 140 mg/kg no mostró diferencias significativas en la mejora del acortamiento del colon en comparación con el grupo modelo, con sólo una diferencia significativa en la mejora de las puntuaciones de tejido patológico. Esto indica que el grupo de dosis bajas de quitosano tiene un mejor efecto protector en los ratones con colitis inducida por DSS. Los resultados mostraron que una dosis de 70 mg/kg de quitosano tenía cierto efecto en el alivio del acortamiento del colon y la protección de la estructura del colon en ratones, lo que es útil para el desarrollo y la aplicación del quitosano a la dosis recomendada a nivel nacional.

En la actualidad, las principales vías de tratamiento de la EII son el estrés oxidativo y la inflamación. Se cree que el estrés oxidativo es la base patogénica de la EII, y el exceso de radicales libres de oxígeno es un factor clave en la formación del daño tisular inflamatorio ulceroso y la colitis. Con la producción de MDA, el exceso de NO genera radicales libres de oxígeno, causando daño oxidativo y dando lugar a la infiltración de un gran número de células inflamatorias en el tejido. Los neutrófilos son las células inmunitarias que más rápidamente se reclutan en el lugar de la inflamación en las primeras fases de la CU. Su función es doble. Por un lado, se agregan en las criptas epiteliales y las cavidades intestinales, y secretan IL-1, IL-6, MPO, etc. liberando especies reactivas del oxígeno (ROS), lo que induce un mayor daño tisular. Por otro lado, mantiene activamente la homeostasis tisular secretando factores antiinflamatorios y puede limitar la invasión microbiana. Qiao et al. descubrieron que los oligosacáridos de quitosano pueden reducir la infiltración de neutrófilos y la peroxidación lipídica en órganos dañados en modelos de ratón con sepsis inducida por LPS. Dou et al. descubrieron que los oligosacáridos de quitosano pueden inhibir la producción de especies reactivas de oxígeno, la degranulación y la adhesión de neutrófilos activados en conejos, ejerciendo así efectos antiinflamatorios. El valor de mieloperoxidasa (MPO) es un marcador del daño tisular y de la infiltración de neutrófilos (PMN), que puede provocar la rotura y ulceración de la mucosa, y está estrechamente relacionado con la EII.

En el experimento, la actividad MPO en los ratones del grupo modelo de colitis aumentó significativamente en comparación con el grupo blanco, lo que indica un aumento significativo de los neutrófilos en el tejido intestinal y una infiltración grave. Tras la intervención del oligosacárido quitosano, la actividad MPO en el tejido del colon disminuyó, aunque no fue significativamente diferente de la del grupo modelo, se observó una tendencia a frenar la agregación de neutrófilos en el intestino y a reducir el daño tisular posterior. Esto concuerda con el descubrimiento de Dou et al. de que los oligosacáridos de quitosano pueden promover la apoptosis de los neutrófilos y reducir la liberación de MPO en ratones con peritonitis glucogénica. Se especula que esto puede estar relacionado con la activación de PLD y PI3K, induciendo la producción de superóxido y otras sustancias por parte de los neutrófilos.

La CU es el resultado de la acción conjunta de múltiples factores, entre los que las citocinas también desempeñan un papel importante. La IL-6 puede estimular la proliferación de células T a bajas concentraciones, activar la proliferación de células B, secretar anticuerpos y participar en la respuesta inflamatoria del organismo a altas concentraciones. TNF-α， También conocido como factor de necrosis tumoral alfa, es producido por los macrófagos II monocitos activados y promueve la apoptosis. IL-6 y TNF - α, como dos importantes citoquinas inflamatorias, son los factores inflamatorios más rápidos y significativos que responden a estímulos patógenos en el cuerpo. Se encuentran habitualmente en diversos procesos patológicos, como enfermedades inmunitarias, respuestas inflamatorias e inmunidad tumoral. En el tejido de la mucosa colónica de pacientes con CU, la expresión de IL-6 y TNF - α es mucho mayor en la fase activa que en la fase de remisión, y también desempeñan papeles importantes en la inflamación y la respuesta inmunitaria de la mucosa intestinal, y se consideran citocinas clave mediadoras de la EII. El factor nuclear kappa B (NF - κ B) es un importante factor de transcripción relacionado con la expresión de citocinas inflamatorias. Cuando se estimula el organismo, I κ B puede activarse y degradarse, activando NF - κ B en el citoplasma y entrando en el núcleo, induciendo la transcripción de genes, y generando diversas inflamatorias o quimiocinas, como IL-1 β, IL-6, IL-12, y TNF - α, que se exacerban aún más a través de la amplificación de retroalimentación. Youself et al. creen que los quitooligosacáridos alivian las reacciones inflamatorias en el cuerpo mediante la inhibición de la vía NF - κ B. En este experimento, la expresión de IL-6 y TNF - α en el tejido del colon de ratones con colitis ulcerosa se incrementó significativamente, mientras que la intervención con dosis bajas y altas de oligosacáridos de quitosano podría reducir significativamente sus niveles de expresión, en consonancia con los resultados de Yang y Youself et al. Indicando que los oligosacáridos pueden mejorar eficazmente los síntomas de la colitis mediante el alivio de las reacciones inflamatorias.

Mediante la comparación de los resultados experimentales de dos dosis de oligosacáridos de quitosano, se encontró que ambas dosis de oligosacáridos de quitosano ralentizaron la pérdida de peso inducida por DSS, el acortamiento del colon, e inhibieron el índice de actividad de la enfermedad, así como el aumento de la actividad MPO. Mejoraron significativamente los cambios histopatológicos y aumentaron los niveles tisulares de TNF-α e IL-6. Entre ellos, el grupo de dosis baja y el grupo de dosis alta tuvieron mejores efectos en el alivio de la longitud del colon y los cambios histopatológicos. Esto indica que el grupo de dosis bajas de COS tiene un mejor efecto en el alivio de los síntomas de la colitis. Yousef et al. trataron ratones con colitis con COS en dosis de 1, 5, 10, 20, 50 y 100 mg/kg y descubrieron que 10 y 20 mg/kg de COS tenían el mejor efecto. También se observaron relaciones similares en forma de campana entre la dosis y el efecto del COS en células T84 inducidas por LPS y TNF - α, lo que sugiere que el COS puede estimular dos vías de señalización diferentes, producir efectos opuestos y causar un antagonismo funcional. La relación entre el efecto de la dosis también se encontró en estudios anteriores en nuestro laboratorio. Ding aplicó COS en dosis de 35, 70, 140 y 210 mg/kg a ratones con hígado graso alcohólico, y descubrió que los grupos de 70 y 140 mg/kg tenían mejores efectos protectores. Los COS de 70 y 140 mg/kg seleccionados en este artículo pueden situarse en el centro y la parte posterior de la forma de campana, y los resultados experimentales muestran que el grupo de dosis bajas tiene efectos ligeramente mejores que el grupo de dosis altas.

En resumen, los oligosacáridos de quitosano pueden aliviar eficazmente los síntomas de la colitis inducida por DSS. Entre ellos, 70 mg/kg de oligosacáridos de quitosano son más eficaces para aliviar la longitud del colon y los cambios histopatológicos en comparación con 140 mg/kg, y son más adecuados como dosis recomendada para uso humano. Entretanto, los oligosacáridos de quitosano pueden desempeñar un papel en la reducción de la inflamación y el alivio de los síntomas de la EII al aliviar la infiltración de neutrófilos e inhibir la liberación de citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, el mecanismo de acción específico de los quitooligosacáridos en la inhibición de la liberación de citocinas inflamatorias aún necesita más verificación.