Investigación sobre el método de detección de alto rendimiento de la ergotioneína del lingzhi
La ergotioneína (EGT), también conocida como sal interna de 2-tio-Lhistidina trimetil, es un aminoácido natural que abunda en muchos animales y plantas. Sólo se sintetiza en algunos microorganismos (actinomicetos, estreptomicetos), hongos y ciertas cianobacterias, y no puede ser sintetizado por los propios organismos animales. El cuerpo humano sólo puede ingerir EGT de los alimentos y acumular altas concentraciones de EGT en diversas células y tejidos a través del transportador de cationes orgánicos altamente específico novel tipo-1 (OCTN1). El EGT se considera un potente antioxidante, y Servillo et al. exploraron su mecanismo antioxidante, creyendo que tiene un mecanismo redox único, y propusieron un efecto antioxidante único del EGT en las células. El potencial estándar de oxidación-reducción del EGT es de -0,06V, mientras que el potencial de otros tioles se sitúa generalmente entre -0,32V y -0,2V. Por lo tanto, el EGT es más estable que otros antioxidantes en entornos de pH fisiológico y es menos propenso a la oxidación espontánea. La investigación ha demostrado que el EGT tiene múltiples funciones fisiológicas importantes, como los efectos antiinflamatorios; la función de protección celular conseguida mediante la protección del ADN; la función antidepresiva conseguida mediante la promoción de la diferenciación neuronal y la neurogénesis; la función de protección ocular conseguida mediante la resistencia al estrés oxidativo; La función de protección cardiovascular y cerebrovascular conseguida mediante la interrupción de la expresión de moléculas de adhesión relacionadas con la aterosclerosis; EGT tiene una amplia gama de perspectivas de aplicación en industrias como la medicina, la alimentación y la cosmética debido a sus efectos preventivos y terapéuticos en enfermedades neurodegenerativas conseguidos mediante la inhibición de la toxicidad, y su seguridad inherente.

Los métodos de producción de EGT incluyen la síntesis química, la extracción de hongos comestibles y la fermentación microbiana. Debido al elevado coste y al complejo proceso de los dos primeros, la fermentación profunda de hifas de hongos comestibles es actualmente el modo principal de producción industrial de EGT. Sin embargo, las cepas naturales tienen una baja producción de EGT, y es necesario cultivar cepas industriales de alto rendimiento de EGT mediante técnicas de cultivo. Los métodos de cultivo de cepas industriales de hongos comestibles incluyen la cría por mutagénesis, la cría por hibridación, la cría por ingeniería genética y la cría por fusión de protoplastos. Sin embargo, cada método de cultivo requiere múltiples pruebas de contenido de EGT a gran escala. Cabe señalar que la importancia de las pruebas de contenido de EGT en el proceso de cría es más para comparar el contenido entre las muestras. En la actualidad, los métodos de detección de EGT incluyen la cromatografía líquida de alto rendimiento, la electroforesis capilar de alto rendimiento y la electroforesis en capa fina. El método más utilizado es la cromatografía líquida de alto rendimiento, que puede detectar con precisión el contenido de EGT de sistemas materiales complejos. Sin embargo, la cromatografía líquida de alto rendimiento tiene sus defectos obvios, es decir, necesita explorar diferentes condiciones de detección para diferentes muestras. Además, debido al tardío tiempo de pico de EGT y a las costosas muestras estándar, el cribado de muestras de alto rendimiento a partir de un gran número de muestras en reproducción puede conducir a un largo tiempo de detección y a un alto coste, lo que dificulta enormemente el desarrollo y la investigación de aplicaciones de EGT. Por lo tanto, es urgente establecer un método de detección rápida de alto rendimiento que pueda determinar con precisión la concentración de EGT entre las muestras.
Debido a sus fuertes propiedades antioxidantes y a su moderada reducibilidad a iones de hierro divalente (ni se ve afectado por el contacto con el oxígeno del aire ni se reduce debido a su débil reducibilidad), el EGT puede reaccionar con iones de hierro divalente para formar quelatos incoloros, mientras que los iones de tiocianato reaccionan con iones de hierro divalente para formar complejos rojos. Basándose en estas características, se seleccionó el tiocianato de hierro como agente reductor en este estudio, y se utilizó el estándar de ergotamina para reaccionar con el tiocianato de hierro con el fin de establecer un sistema de detección de alto rendimiento para la ergotamina. Al mismo tiempo, el sistema de detección de alto rendimiento se validó variando los rendimientos de EGT de diferentes cepas de Ganoderma lucidum. Los resultados de este estudio proporcionarán nuevos métodos e ideas para el cribado de microorganismos EGT de alto rendimiento y la obtención de nuevas cepas EGT de alto rendimiento.

Basándose en las propiedades fisicoquímicas fuertemente reductoras de la ergotioneína, antes de construir el sistema EGT de tiocianato de hierro, se realizaron experimentos para construir el sistema de permanganato potásico alcalino, el sistema de verde de bromocresol, el sistema de azul de metileno de botella azul, el sistema de guayacol y el sistema EGT de cloruro férrico. Los resultados mostraron que el sistema de permanganato potásico alcalino falló debido a su baja estabilidad; el desarrollo del color del sistema de verde de bromocresol falló debido a la dependencia del pH; en el sistema de azul de metileno de botella azul, debido a la fuerte reducibilidad del azul de metileno en estado reducido, también se oxida fácilmente a azul de metileno cuando entra en contacto con el oxígeno del aire, lo que resulta en el fracaso del experimento sin ningún fenómeno; el sistema de guayacol también falló debido a la fuerte reducibilidad y a la interferencia del contacto con el oxígeno; el sistema de cloruro férrico falló debido a la baja reproducción del color. El sistema de tiocianato de hierro EGT puede utilizarse para el estudio de métodos de detección de alto rendimiento para EGT.

Durante la construcción del sistema de detección de hierro por tiocianato EGT, se descubrió que las sustancias fenólicas residuales en la solución de extracción afectarían a la reacción de color del sistema y reducirían su sensibilidad cuando la muestra analizada se extrajera utilizando el método ordinario de extracción de crudo EGT, es decir, la extracción de volumen constante por soplado de nitrógeno con precipitación de alcohol. Por lo tanto, después de la extracción a volumen constante con soplado de nitrógeno, es necesario añadir a la solución de extracción en bruto una etapa de eliminación de fenol con cloroformo.
El Ganoderma lucidum es un hongo medicinal tradicional y preciado en China, que contiene diversas sustancias bioactivas y funciones fisiológicas. Su contenido de ergotioneína es relativamente alto entre muchos hongos comestibles, pero como cepa producida comercialmente, su rendimiento sigue siendo bajo. Por lo tanto, el cultivo de una nueva cepa de Ganoderma lucidum con alta producción de ergotioneína es de gran importancia y valor de aplicación práctica. Basándose en las razones anteriores, nuestro laboratorio ha obtenido un lote de productos de pseudofusión a través de la regeneración, aislamiento e identificación de protoplastos de fusión. Todos los productos de fusión de Ganoderma lucidum utilizados en el proceso de validación de este método proceden de esta fuente.
El método establecido en este estudio se basa en las propiedades físicas y químicas del propio EGT, y el sistema de detección es sensible y estable. Es adecuado para la comparación rápida de grandes cantidades de muestras en el proceso de cultivo de cepas de fermentación industrial productoras de EGT. En teoría, sólo se necesita una simple optimización de la extracción de la muestra de EGT para lograr una detección rápida de alto rendimiento del contenido de EGT en la gran mayoría de las cepas, rompiendo las limitaciones de la investigación original de EGT y proporcionando nuevos métodos e ideas para el desarrollo general y la investigación de la aplicación de EGT.