Investigación sobre marcadores característicos del crisantemo basada en espectros característicos de HPLC combinados con quimiometría
El crisantemo es la inflorescencia seca de la cabeza de la planta Asteraceae Chrysanthemum morifolium Ramat. Contiene principalmente partes activas como flavonoides, aceites volátiles, ácidos orgánicos y oligoelementos. Tiene los efectos de dispersar el viento, despejar el calor, calmar el hígado, mejorar la visión y despejar el calor y desintoxicar. La edición de 2020 de la Farmacopea China incluye variedades de crisantemo como "Boju", "Chuju", "Gongju", "Hangju" y "Huaiju" según su lugar de origen y métodos de procesamiento. Como hierba medicinal china con propiedades medicinales y comestibles, el crisantemo tiene las características de una amplia variedad y una compleja composición de ingredientes. Sin embargo, las distintas variedades de crisantemo presentan diferencias significativas en su composición química debido a sus diferentes entornos de crecimiento, métodos de cultivo y procesamiento, y calidad desigual, lo que da lugar a diferentes efectos terapéuticos clínicos. En la actualidad, la edición 2020 de la Farmacopea China utiliza el contenido de tres componentes químicos, ácido clorogénico, luteolina-7-O - β - D-glucósido y ácido 3,5-O-dicafoilquínico, como indicadores de evaluación, lo que dificulta la evaluación exhaustiva de la calidad de los materiales medicinales del crisantemo.
El espectro característico de la medicina tradicional china puede caracterizar los cambios generales en la calidad interna de la medicina tradicional china. Cada vez más medicinas tradicionales chinas utilizan el establecimiento de espectros característicos de huella dactilar para el control de calidad, entre los cuales la tecnología de huella dactilar característica HPLC también se utiliza comúnmente en la identificación de variedades de crisantemo y la investigación de control de calidad. El marcador de calidad de la medicina tradicional china (Q-Marker) se compone de componentes químicos exclusivos, clínicamente eficaces y controlados que están relacionados con las propiedades funcionales de la medicina tradicional china. Puede reflejar la seguridad y la eficacia de la medicina tradicional china y puede utilizarse para construir un sistema moderno de evaluación de la calidad integral, sistemático y cuantitativo para la medicina tradicional china. Sobre la base de Q-Marker, mediante la integración de espectros de huellas dactilares y métodos quimiométricos, se pueden descubrir componentes que reflejen características comunes en hierbas medicinales o fórmulas, y se puede establecer un sistema de evaluación de calidad multidimensional que se ajuste a las características de la medicina tradicional china. Esto puede proporcionar una mejor solución para la supervisión científica de la medicina tradicional china.
Sobre la base de investigaciones anteriores sobre crisantemos, este estudio estableció cromatogramas característicos de HPLC de diferentes variedades de crisantemos, combinados con métodos quimiométricos para examinar la base de sustancias comunes de los crisantemos como marcadores característicos. Al mismo tiempo, se examinaron las diferencias significativas en los marcadores característicos entre las distintas variedades de crisantemos, proporcionando una base científica para la evaluación general de la calidad, la identificación de variedades y la evaluación de las características de una sola variedad de crisantemos.

 

Selección de los métodos de extracción. Este experimento investigó los efectos de diferentes disolventes (metanol 70%, metanol 50%, metanol 80%), métodos de extracción (extracción ultrasónica y extracción por reflujo térmico) y tiempos de extracción (30, 35, 40 minutos) en los cromatogramas, y determinó utilizar la extracción ultrasónica con metanol 70% durante 40 minutos como método de extracción.
Optimización de las condiciones cromatográficas. En este experimento se examinaron diferentes columnas cromatográficas (columna Agilent XDB-C18 Phenomenex Luna C18)、 Longitudes de onda de detección (220, 254, 330, 348 nm) y sistemas de fase móvil (acetonitrilo -0,1% agua de ácido fosfórico, acetonitrilo -0,1% agua de ácido fórmico, acetonitrilo -0,2% agua de ácido acético), y se utilizaron como indicadores de evaluación la forma de los picos cromatográficos, el número de picos y la resolución. Por último, se seleccionó una columna cromatográfica Agilent XDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 µ m) con una longitud de onda de detección de 348 nm y solución acuosa de acetonitrilo -0,2% ácido acético como sistema de fase móvil.
Las cinco variedades diferentes de mapas de control del crisantemo establecidas en el experimento tienen diferentes picos comunes y picos característicos identificados. En los mapas de control establecidos de Boju, Chuju, Gongju, Hangju y Huaiju, se identificaron 21, 20, 25, 22 y 22 picos comunes respectivamente, y se identificaron 14, 14, 12, 13 y 13 picos característicos principales comparándolos con la muestra de control; En el espectro de control del crisantemo generado a partir de 50 lotes de muestras de crisantemo, se identificaron 17 picos comunes, incluyendo ácido neoclorogénico, ácido clorogénico, ácido criptoclorogénico, luteolina-7-O - β - D-glucósido, ácido isoclorogénico B, ácido 3,5-O-dicafoilquínico, apigenina 7-O - β - D-glucósido, ácido isoclorogénico C, vanilolignina 7-O - β - D-glucósido, vanilogenina, apigenina y luteolina. Como el ácido cafeico no se identificó en Gongju, Hangju y Huaiju, y la acacetina no se identificó en Gongju, el ácido cafeico y la acacetina no se utilizaron como picos comunes en el espectro de control del crisantemo. Al comparar las áreas de los picos, se descubrió que había diferencias significativas en las áreas de los picos correspondientes a luteolina-7-O - β - D-glucósido, apigenina, apigenina 7-O - β - D-glucósido y ácido isoclorogénico C entre los cinco espectros de control del crisantemo. En los espectros de control de Gongju y Hangju, las áreas de los picos de luteolina-7-O - β - D-glucósido y ácido isoclorogénico C fueron mayores, mientras que en los otros tres espectros de control de crisantemos, sus áreas de los picos fueron menores; En los espectros de control de Boju, Chuju y Huaiju, el área del pico de apigenina es relativamente grande, mientras que en los espectros de control de Gongju y Hangju, su área del pico es muy pequeña; El área del pico de apigenina 7-O - β - D-glucósido es mayor en el espectro de control del crisantemo de Hangzhou, mientras que es menor en los otros cuatro espectros de control del crisantemo. Así pues, comparando las diferencias entre los picos característicos de las cinco variedades de crisantemos, podemos reflejar de forma preliminar las diferencias entre las distintas variedades de crisantemos, lo que indica que existen ciertas diferencias en los tipos y contenidos de componentes químicos en las distintas variedades de crisantemos.
Los resultados de la evaluación de la similitud muestran una alta similitud intraespecie, lo que indica que las diferencias entre crisantemos de la misma variedad procedentes de distintos lotes son relativamente pequeñas; la baja similitud interespecie es de 0,391-0,690, lo que indica diferencias significativas en la composición química de las distintas variedades de crisantemos. CA, PCA y OPLS-DA pueden clasificar con precisión cinco variedades diferentes de crisantemos en cinco categorías. Aunque las cinco variedades de crisantemos son diferentes, también tienen similitudes. PCA y OPLS-DA dividen las cinco regiones específicas en dos categorías: izquierda y derecha. Entre ellas, Boju, Chuju y Huaiju se clasifican en una categoría (con fines medicinales), mientras que Gongju y Hangju se clasifican en una categoría (con fines medicinales). El análisis quimiométrico muestra que la cumarina-7-O - β - D-glucósido, el ácido isoclorogénico C y la apigenina son los principales componentes diferenciales de las dos categorías, que pueden utilizarse como marcadores característicos para distinguir las diferencias entre los dos tipos de crisantemos. OPLS-DA cribó 7 componentes marcadores principales, e identificó 4 componentes incluyendo apigenina, apigenina 7-O - β - D-glucósido, luteolina-7-O - β - D-glucósido, y ácido isoclorogénico mediante comparación con estándares de referencia mixtos. Estos componentes pueden utilizarse como marcadores característicos para distinguir las diferencias entre las distintas variedades de crisantemos, lo que queda corroborado por la comparación de las áreas de los picos. Entre ellos, los picos 24, 11 y 20 no se identificaron, y su papel en la evaluación de la calidad del crisantemo requiere más investigación; Diez componentes con valores VIP inferiores a 1, incluyendo el ácido isoclorogénico B, el ácido 3,5-O-dicafoilquínico, la vainillina, el ácido criptoclorogénico, el ácido clorogénico, el ácido neoclorogénico, la luteolina y el 7-O - β - D-glucósido de vainillina, pueden utilizarse como marcadores característicos del crisantemo en su conjunto.
En resumen, este experimento estableció y analizó los espectros característicos por HPLC de cinco variedades de crisantemo, comparó los picos característicos y sus correspondientes áreas de pico, y realizó una evaluación de similitud, demostrando preliminarmente las diferencias entre diferentes variedades de crisantemo; Mediante el uso de métodos quimiométricos para analizar y cribar las mismas sustancias entre diferentes variedades de crisantemo como marcadores característicos que representan la eficacia del crisantemo y reflejan las diferencias entre diferentes crisantemos, se proporciona una base científica para la identificación de variedades de crisantemo y la evaluación de la calidad.