Estudio del efecto inmunomodulador de las saponinas de Panax ginseng y Panax ginseng en células RAW 264.7 in vitro
Los macrófagos implicados en la inmunidad inespecífica del organismo constituyen la primera línea de defensa contra los agentes patógenos. Los macrófagos activados pueden liberar diversos factores inflamatorios y citoquinas (como NO y TNF - α) para participar en la respuesta inmunitaria del organismo y regular la respuesta inmunitaria. La investigación ha demostrado que las saponinas de la medicina tradicional china pueden activar los macrófagos, mejorar la capacidad fagocítica celular, promover la secreción de moléculas activas relacionadas y regular al alza la expresión de proteínas relacionadas. Las saponinas de las raíces de fibroblastos de Radix Pseudostellaria (RPFRS) son uno de los componentes bioactivos aislados de las raíces de ginseng de Pseudostellaria heterophylla, que tienen los efectos de mejorar la inmunidad del organismo, la antioxidación, etc. En la actualidad, la raíz principal del Panax ginseng se utiliza como medicamento, mientras que la seda de la raíz se desecha, lo que provoca un gran desperdicio. La investigación ha descubierto que el contenido medio de saponinas totales en la seda de la raíz de Panax ginseng es 1,14 veces superior al del tubérculo de la raíz. La investigación preliminar del grupo de investigación ha demostrado que el extracto de Panax ginseng y Panax ginseng, compuesto principalmente de saponinas, tiene un efecto inmunoprotector en ratones inmunodeprimidos y puede mejorar su función inmunológica. En la actualidad, existen pocos informes sobre los efectos inmunitarios del RPFRS por sí solo, y los macrófagos mononucleares de ratón (células RAW 264.7) se utilizan a menudo como modelo para los estudios de actividad inmunitaria in vitro. Por lo tanto, este experimento se centró en las células RAW 264.7 y estudió los efectos inmunomoduladores y los posibles mecanismos de los RPFRS in vitro mediante la detección de indicadores inmunológicos como la proliferación celular, la actividad fagocítica, las citocinas relacionadas y la expresión de ARNm. El objetivo del estudio es enriquecer el contenido inmunológico del RPFRS y proporcionar una base teórica para el desarrollo y la utilización del Panax ginseng.

 

Efecto de los RPFRS en la proliferación de células RAW 264.7. Las saponinas tienen ciertas propiedades hemolíticas y tóxicas, y presentan dosis tóxicas más bajas en comparación con otros extractos vegetales, por lo que debe prestarse atención a la dosificación cuando se utilicen. Para determinar si el RPFRS tiene efectos tóxicos sobre las células RAW 264.7 y buscar la concentración óptima de RPFRS para los experimentos, se utilizó el método MTT para determinar el efecto de diferentes concentraciones de RPFRS sobre la proliferación de células RAW 264.7. Los resultados de este experimento mostraron que RPFRS podría promover significativamente la proliferación de células RAW 264,7 en el rango de concentración de 12,5-800 μ g / ml (P <0,01), y mostró una relación dosis-respuesta en el rango de concentración de 12,5-100 μ g / ml. Por lo tanto, se seleccionaron concentraciones de 12,5-200 μ g/mL para los experimentos posteriores.

Efecto del RPFRS en la actividad fagocítica de las células RAW 264.7. La fagocitosis es una de las principales funciones de los macrófagos. En la inmunidad no específica, los macrófagos pueden eliminar o digerir patógenos dentro de las células, células muertas del cuerpo y otros antígenos de partículas grandes mediante la fagocitosis. En la inmunidad específica, pueden desempeñar un papel en la regulación inmunitaria y la presentación de antígenos. Existen informes de investigación que indican que tanto las saponinas D de Platycodon grandiflorus como las saponinas de Magnolia grandiflorus pueden mejorar la capacidad fagocítica de los macrófagos de ratón. En consonancia con estudios anteriores, los resultados de este experimento indican que RPFRS puede aumentar el valor de DO de la fagocitosis de células RAW 264.7 de rojo neutro de una manera dependiente de la dosis a concentraciones de 12,5-200 μ g / ml (P <0,01), lo que indica que RPFRS puede mejorar la actividad fagocítica de las células RAW 264.7 y mejorar su función inmune.

Efecto del RPFRS sobre la secreción de NO y la expresión de ARNm de la iNOS en células RAW 264.7. Los macrófagos pueden eliminar patógenos desencadenando respuestas inmunitarias inflamatorias y ayudar al organismo a regular respuestas inmunitarias específicas, mientras que el NO sintetizado por la óxido nítrico sintasa (iNOS) está estrechamente relacionado con su función de respuesta inmunitaria inflamatoria. Yang et al. encontró que el hidrolizado de proteína de Panax ginseng puede promover las células RAW 264 para secretar NO y activar los macrófagos con TNF - α, la mejora de su actividad inmune. Los resultados de este experimento mostraron que, en comparación con el grupo de control en blanco, RPFRS podría aumentar significativamente el contenido de NO en el sobrenadante de células RAW 264.7 (P <0,05), y al mismo tiempo, la expresión de iNOS en células RAW 264.7 también se incrementó significativamente (P <0,01), ambos de los cuales mostraron un aumento dependiente de la dosis. Este resultado concuerda con los hallazgos de Li et al. de que el astragalósido IV puede aumentar la expresión de NO y ARNm de iNOS en el sobrenadante de las células RAW 264.7.
Efecto del RPFRS sobre la secreción de citocinas y la expresión de ARNm en células RAW 264.7. Citoquinas como la IL-6, IL-10, IL-1 β, y TNF - α desempeñan principalmente un papel en las respuestas inflamatorias locales y sistémicas. La IL-6 puede inducir a los precursores de linfocitos B a convertirse en células secretoras de anticuerpos. La IL-10, como factor antiinflamatorio, puede inhibir la actividad de los macrófagos y las citocinas inflamatorias como la IL-6 y el TNF - α. La IL-1 β puede promover la activación y degranulación de macrófagos y neutrófilos, así como la expresión de otros factores inflamatorios. El TNF α es la principal citoquina proinflamatoria producida por los macrófagos en respuesta a diversos estímulos, que puede promover la secreción de citoquinas como la IL-6 y la IL-8. Sun et al. descubrieron que la saponina de soja Ab puede aumentar los niveles de TNF - α e IL-1 β en el sobrenadante de células RAW 264.7. Li et al. encontró que el astragalósido IV puede aumentar los niveles y la expresión de ARNm de IL-6, IL-1 β, y TNF - α en el sobrenadante de células RAW 264.7. Los resultados de este estudio mostraron que en comparación con el grupo de control en blanco, RPFRS podría dosis dependiente aumentar los niveles de IL-6, IL-10, IL-1 β, y TNF - α en el sobrenadante de células RAW 264.7. RPFRS también aumentó los niveles de expresión de ARNm de IL-6, IL-10, IL-1 β, y TNF - α en las células RAW 264.7 en diversos grados, lo que indica que RPFRS puede regular su función inmune mediante la estimulación de la secreción de citoquinas.
Efecto de la RPFRS en la expresión de proteínas relacionadas con la vía NF - κ B en células RAW 264.7. El NF - κ B, como factor de transcripción nuclear, puede activar la expresión de diversos genes relacionados con las primeras respuestas de defensa, regulando así procesos fisiológicos como la apoptosis celular, la respuesta inmunitaria, la inflamación y la remodelación tisular. La activación de la vía de señalización NF - κ B es estimulada por varias moléculas de señalización. TLR2 y TLR4, como miembros de la familia de receptores de reconocimiento de patrones, están altamente expresados en las superficies de macrófagos, células B y células DC, y pueden monitorizar y reconocer patrones moleculares relacionados con enfermedades para iniciar la transducción de señales en la vía de señalización. Estos últimos también pueden estimular MyD88 para desencadenar una cascada de señalización e inducir la activación de NF - κ B. MyD88 y TRIF se unen a las proteínas de unión TLR en el citoplasma, activan la vía MAPK bajo la acción de la ubiquitina, promueven la fosforilación de I κ B - α para activar la vía NF - κ B, y regulan la expresión génica corriente abajo. He et al. encontraron que después de la intervención con diferentes dosis de saponinas totales de Platycodon grandiflorum, los niveles de IL-6, IL-1 β, y TNF - α en el tejido sinovial de la articulación del tobillo de ratas con artritis inducida por colágeno disminuyeron, mientras que los niveles de TLR2, TLR4, MyD88 y otras proteínas disminuyeron. Shin et al. encontró que ginsenósidos tratados con calor Rg1 y Rg3 puede promover la secreción de IL-6 y TNF - α en células RAW264.7, así como la fosforilación de MAPK y la degradación de I κ B - α para activar el NF - κ B vía de señalización. Los resultados de este experimento mostraron que, bajo la acción del RPFRS, la expresión del ARNm de TLR4 en las células RAW 264.7 disminuyó, mientras que la expresión de ARNm de MyD88 y NF - κ B aumentó; En consonancia con esto, los resultados de WB mostraron una disminución en la expresión de TLR4, I κ B α, y citoplasmática NF - κ B proteínas, mientras que la expresión de TLR2, MyD88, TRIF, y nuclear NF - κ B proteínas aumentó, lo que indica la translocación de NF - κ B desde el citoplasma al núcleo. Tras la activación de la vía NF - κ B, puede revertir la inducción de la transcripción mediada por citoquinas proinflamatorias, lo que se corresponde con los resultados del contenido de citoquinas y la expresión de ARNm mencionados anteriormente. Esto indica que el RPFRS puede activar las células RAW 264.7 a través de la vía de transducción TRIF/MyD88-NF - κ B mediada por TLR2 y TLR4.
Los RPFRS pueden promover la proliferación de las células RAW 246.7, mejorar la actividad fagocítica, aumentar el contenido y la expresión de ARNm de las citocinas relacionadas, regular a la baja la expresión de ARNm de TLR4, regular al alza la expresión de TLR2, MyD88, TRIF y la proteína nuclear NF - κ B, regular a la baja la expresión de TLR4, I κ B - α y la proteína citoplasmática NF - κ B, y mostrar un cierto efecto de dosis. RPFRS puede ejercer protección inmune mediante la inhibición de la estimulación de TLR4 por LPS, y también puede activar las células RAW 264.7 a través de la vía de señalización TLR2/4-MyD88/TRIF-NF - κ B, participando en el proceso de respuesta inmune y ejerciendo efectos reguladores inmunes. Es necesario seguir investigando la relación entre el RPFRS y otras vías de señalización implicadas en la regulación inmunitaria de las células RAW 264.7, así como sus componentes y la actividad inmunitaria.