Determinación simultánea de seis flavonoides en hojas de Wuyao mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución y espectrometría de masas en tándem
Lindera aggregata (Sims) Kosterm, planta perteneciente a la familia del alcanfor y al género Piper, tiene efectos antiinflamatorios, analgésicos, antioxidantes y antitumorales. Se produce principalmente en las provincias costeras del sureste de China, siendo el condado de Tiantai, en la provincia de Zhejiang, el más famoso, de ahí que reciba el nombre de Tiantai Wuyao. En 2018, fue seleccionado como uno de los nuevos "Ocho Sabores de Zhejiang" en Zhejiang. La investigación farmacológica moderna ha demostrado que la medicina negra también tiene efectos inmunomoduladores sobre el sistema nervioso central y el sistema cardiovascular, por lo que sus perspectivas de mercado son amplias. Sin embargo, las partes medicinales del Wuyao crecen lentamente y a menudo tardan entre 8 y 10 años en cumplir los requisitos para el procesamiento de hierbas medicinales de calidad. Durante el ciclo de crecimiento, sus partes de tallo y hoja suelen desecharse, lo que supone un bajo aprovechamiento de los recursos. En las zonas populares de Zhejiang, las hojas de Wuyao se utilizan a menudo para tratar la celulitis aguda, la artritis reumatoide y otras inflamaciones, y también se suelen preparar en bebidas de té para reducir los lípidos, proteger el hígado y obtener otros beneficios para la salud. Estudios anteriores han demostrado que los extractos de hoja de Wuyao tienen cierto efecto hipolipemiante. El equipo de investigación realizó un estudio de correlación farmacológica de los extractos de hoja de Wuyao y descubrió que tienen un determinado mecanismo de acción contra la hiperlipidemia y la osteoporosis. Al mismo tiempo, también se llevó a cabo la separación sistemática de componentes químicos y la extracción de las hojas de Wuyao en la fase inicial. Se aislaron por primera vez seis flavonoides del extracto etanólico de las hojas de Wuyao, que se identificaron como: kaempferol-3-O - α - L-ramnósido (1), quercetina (2), kaempferol-3-O - β - D-xilósido (3), kaempferol-3-O - α - L-arabinofuranósido (4), kaempferol-3-O - (2 ″ -3-O-trans-3-O-p-3-O-cumaroil) - α - L-ramnósido (5), kaempferol-3-O - (2 ″, 4 ″ -3-O-di-3-O-3-3-3-O-di-3-glucósido) O-trans-3-O-p-3-O-cumaroil) - α - L-ramnósido (6), estructura química mostrada en la figura 1.

En la actualidad, existen informes de investigación relevantes sobre la evaluación de la calidad de las hojas de Wuyao. Yi et al. utilizaron HPLC para determinar el contenido de cuatro flavonoides en hojas de Wuyao de diferentes orígenes en la provincia de Hunan. Sun et al. utilizaron espectrofotometría UV para determinar el contenido total de flavonoides en extractos de hojas de Wuyao e investigaron los factores relevantes para la extracción de flavonoides totales, con el fin de optimizar el proceso de extracción. Al mismo tiempo, Sun et al. utilizaron HPLC para determinar el contenido de cuatro lactonas sesquiterpenoides en hojas de Wuyao de diferentes orígenes. Sin embargo, se trata de métodos de detección tradicionales, que carecen de gran eficacia y precisión en la determinación del contenido. Con el avance de la tecnología de espectrometría de masas, se ha desarrollado la tecnología de espectrometría de masas en tándem por cromatografía líquida de ultra alto rendimiento con alta eficiencia, alta especificidad y alta sensibilidad. La espectrometría de masas en tándem por cromatografía (UPLC-MS/MS) se ha convertido en un importante método analítico para detectar la calidad de los materiales medicinales tradicionales chinos. Por lo tanto, este estudio utilizará la tecnología UPLC-MS/MS para estudiar cuantitativamente los seis flavonoides principales en las hojas de Wuyao de diferentes orígenes, y combinar el peso de entropía - α - L-método de clasificación de solución ideal aproximada (TOPSIS) para el análisis y la evaluación, con el fin de proporcionar una base científica para el control de calidad interno de las hojas de Wuyao.

 

Selección de las condiciones de extracción. En este estudio, se utilizó el método UPLC-MS/MS para determinar simultáneamente el contenido de seis compuestos indicadores, a saber, kaempferol-3-O - α - L-ramnósido (1), quercetina (2), kaempferol-3-O - β - D-xilósido (3), kaempferol-3-O - α - L-arabinofuranoside (4), kaempferol-3-O - (2"- trans - p-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (5), y kaempferol-3-O - (2", 4 "- di trans - p-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (6), en hojas de Wuyao en 10 minutos. Las concentraciones de metanol fueron 30%, 50% y 70%, respectivamente. Basándose en el análisis del espectro, se seleccionó el metanol 70% para obtener el mejor efecto de extracción. Al mismo tiempo, se compararon los métodos de extracción por reflujo térmico y por ultrasonidos. Según los resultados de contenido, las tasas de extracción obtenidas eran comparables. Teniendo en cuenta el tiempo y los costes de los consumibles, se optó por la extracción por ultrasonidos.
Condiciones de cromatografía de espectrometría de masas. En este estudio se investigaron tres sistemas de fase móvil: agua acetonitrilo, agua acetonitrilo-0,1% ácido fórmico y agua acetonitrilo-0,1% formiato amónico. El área del pico y la forma del pico de seis flavonoides se utilizaron como indicadores de evaluación para determinar el sistema de fase móvil apropiado. Se encontró que cuando se seleccionó agua acetonitrilo como fase móvil, hubo un fenómeno de cola en los compuestos de kaempferol-3-O - (2 "- trans-pcoumaroyl) - α - L-rhamnoside y kaempferol-3-O - (2", 4 "- di-trans-pcoumaroyl) - α - L-rhamnoside; Cuando acetonitrilo 0..1% agua de formiato de amonio como fase móvil, la quercetina 3-O - α - L-arabinofuranosido muestra una ligera cola; Cuando se eligió acetonitrilo 0,1% agua de ácido fórmico como fase móvil, las formas de los picos de los seis compuestos fueron relativamente simétricas. Por lo tanto, se eligió acetonitrilo 0,1% ácido fórmico agua como sistema de fase móvil. En la selección de las condiciones de espectrometría de masas, el estudio utilizó los modos de iones positivos y negativos para determinar el contenido de seis compuestos diana. Con el fin de garantizar que los compuestos objetivo tengan una mayor estabilidad, valores de respuesta más altos y mejores formas de pico, múltiples experimentos repetidos han demostrado que el uso del modo de barrido de iones negativos para la detección puede hacer que los seis compuestos flavonoides sean más estables, con mejores formas de pico y valores de respuesta en las condiciones de detección. Al mismo tiempo, durante la investigación de las condiciones de cromatografía-espectrometría de masas, los tiempos de retención de los flavonoides 2 y 5 extraídos del cromatograma iónico de la figura 2 eran básicamente los mismos. En comparación con las técnicas tradicionales de análisis HPLC, la cromatografía-espectrometría de masas basada en el análisis de relación masa-carga no depende de la separación pico a pico, y tiene un tiempo de recogida de señal corto y una alta sensibilidad. Por lo tanto, en este estudio, se utilizó la tecnología de análisis UPLC-MS/MS para determinar simultáneamente seis flavonoides en las hojas de Wuyao, que tiene más ventajas.
Análisis de resultados. En este estudio se recogieron muestras medicinales de 10 zonas de producción de Wuyao en China y se utilizó la tecnología UPLC-MS/MS para determinar simultáneamente el contenido de seis componentes químicos en las hojas de Wuyao. Se utilizó el método TOPSIS de peso de entropía para analizar y evaluar exhaustivamente los seis compuestos de las 10 zonas de producción. La clasificación exhaustiva fue la siguiente: Tiantai, Zhejiang>Jinhua, Zhejiang>Changsha, Hunan>Ningde, Fujian>Kunming, Yunnan>Tonglu, Zhejiang>Guilin, Guangxi>Yingtan, Jiangxi. Los resultados mostraron que la calidad integral de las hojas de Wuyao en Tiantai, Zhejiang, era relativamente alta, lo que está relacionado con la creencia tradicional de que Tiantai, Zhejiang, es una auténtica zona de producción de material medicinal de Wuyao. Al mismo tiempo, también confirma el registro del Compendio de Materia Médica de que para el Wuyao, Tiantai es la ganadora; el Diccionario de Medicina Tradicional China registra que la producción de Wuyao es la mayor de Zhejiang, y la calidad de los productos producidos en Tiantai, Zhejiang es la mejor, de ahí que se le llame "Tiantai Wuyao" o "Tai Wuyao". Al mismo tiempo, los resultados de la evaluación también reflejan que hay diferencias significativas en el contenido de seis flavonoides principales en las hojas de Wuyao de distintos orígenes, y también hay diferencias significativas en las hojas de Wuyao de distintas ciudades de la misma provincia. Esto puede estar relacionado con las fuentes de introducción de Wuyao en diferentes bases de plantación y diferentes entornos ecológicos.
En la actualidad, la Wuyao Ye ha sido aprobada como nuevo alimento de recurso, por lo que se seguirá explorando el desarrollo de su producto. Este estudio ha establecido un método que es fácil de operar, tiene buena precisión, estabilidad y repetibilidad, y puede determinar simultáneamente el contenido de seis flavonoides en Wuyao Ye. Puede utilizarse para el análisis cuantitativo y la evaluación exhaustiva de los principales flavonoides en Wuyao Ye, y el método TOPSIS de peso de entropía utilizado también proporciona una base teórica para evaluar la calidad de otras hierbas medicinales con valor medicinal.