Verteilung endophytischer Bakterien und vorläufiges Screening steroidale Saponine produzierender Stämme in Xiangmaidong in verschiedenen Wachstumsstadien
Xiangmaidong, auch bekannt als Hubei maidong Liriope spicata var. prolifera Y.T. Ma, ist eine der Quellpflanzen von Shanmaidong im Arzneibuch der Volksrepublik China (Ausgabe 2010). Sein Hauptwirkstoff sind Steroidsaponine, deren Sapogenin-Grundgerüst zu den Spirostanderivaten (bestehend aus 27 Kohlenstoffatomen) gehört. Entsprechend der C25-Konfiguration in der Spirostan-Struktur und dem zyklischen Zustand des F-Rings kann es in die folgenden vier Haupttypen unterteilt werden: Spirostanol (C25 ist S-Konfiguration), Isosterostanol (C25 ist R-Konfiguration) und Furostanol (F-Ring ist ein offenkettiges Derivat).), modifizierte Spirostanol-Alkohole (F-Ring ist ein fünfgliedriger Tetrahydrofuran-Ring). Aus Ophiopogon japonicus wurden vierzehn Arten von Steroidsaponinen isoliert, wobei die wichtigsten Glykoside Diosgenin und Ruscogenin sind, bei denen es sich um C25(S)-Isomere handelt. Unter ihnen ist der Gehalt an Saponinen C (Ls-S3) in Ophiopogon japonicus relativ hoch. Steroidsaponine haben vielfältige pharmakologische Wirkungen, und mit Ausnahme einiger weniger, die chemisch synthetisiert werden können, werden sie hauptsächlich durch chemische Extraktion direkt aus traditionellen chinesischen Heilpflanzen gewonnen. Die Xiangmaidong-Steroidsaponine bilden da keine Ausnahme. Aufgrund von Problemen wie langen Produktionszyklen, ständigen Erntehindernissen auf dem Feld, geringem Saponingehalt, hohen Extraktionskosten und erheblicher Umweltverschmutzung sind die nachhaltige Produktion und Versorgung mit Xiangmaidong-Saponinen jedoch eingeschränkt. Daher ist es notwendig, nach neuen Wegen zu suchen, um Saponine in großen Mengen herzustellen.

In früheren Studien wurde über die Isolierung von endophytischen Bakterien berichtet, die in der Lage sind, steroidale Saponine aus Dianzhong- und Huazhong-Gebäuden zu produzieren. Davon inspiriert versuchte unser Forschungsteam, endophytische Bakterienstämme zu isolieren und zu entdecken, die steroidale Saponine aus Xiangmaidong metabolisieren und produzieren. Mithilfe von Reinkulturmethoden und der 16SrDNA-PCRDGGE-Technologie analysierten und identifizierten wir die Verteilung endophytischer Bakterien in Proben (Knollen oder Wurzeln) von Xiangmaidong während des ersten Auftretens, der schnellen Expansion und der reifen Erntezeit. Gleichzeitig wurden Farbreaktions-, TLC- und HPLC-Methoden verwendet, um die Fähigkeit zur Saponinproduktion der erhaltenen rein kultivierten Stämme vorläufig zu bewerten, um die Zielstämme zu erhalten und die theoretische Unterstützung für die "fabrikmäßige, maßstabsgetreue und schnelle" Produktion von Steroid-Saponinen zu liefern.

Mit Hilfe traditioneller mikrobieller Reinkulturverfahren wurden in dieser Studie 15 Gattungen und 22 Arten endophytischer Bakterien aus den Wurzelknollen und faserigen Wurzeln von Xiangmaidong in verschiedenen Wachstumsstadien isoliert. Darunter waren 4 Arten von Bacillus und 4 Arten von Staphylococcus, 2 Arten von Pseudomonas und die restlichen 12 Gattungen, darunter Salmonella, Enterobacter, Pseudoxanthomonas, Morganella, Agrobacterium, Microbacterium, Porphyromobacter, Acinetobacter, Lysinibacter und Sphingosine. Es gibt nur eine Bakterienart in den Gattungen Sphingomonas, Sphingomonas und Curtobacterium.

Durch 16SrDNA-PCR-DGGE-Identifizierung wurde in dieser Studie festgestellt, dass die Struktur der endophytischen Bakteriengemeinschaft von Xiangmaidong während des anfänglichen Auftretens, der raschen Ausbreitung und der reifen Erntezeit der Knollen im Wesentlichen gleich war und sich die Stammgruppen kaum unterschieden. Durch Sequenzabgleich wurden aus den isolierten Sequenzen 15 Gattungen und 21 Bakterienarten identifiziert, darunter 3 Arten von Bacillus und 3 Arten von Staphylococcus, 2 Arten von Serratia und 2 Arten von Pseudomonas, und die übrigen 11 Gattungen, darunter Pseudomonas, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Porphyromobacter, Curtobacterium, Enterobacter, Methylobacterium, stickstofffixierend. Es gibt nur einen Stamm von Azotobacter, Microbacterium und Pseudoclavibacter. Im Vergleich zu den oben genannten 22 Stämmen reiner endophytischer Bakterien hat die DGGE 7 neue Gattungen identifiziert: Serratia, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Methylobacterium, Azotobacter und Pseudomonas.

In dieser Studie wurde die Fähigkeit zur Saponinproduktion rein kultivierbarer endophytischer Stämme bewertet und vorläufig drei Bakterienstämme, Pseudoxanthomonas mexicana, Staphylococcus caprae und Microbacterium testaceum, mit signifikanten Merkmalen zur Produktion von Steroidsaponinen identifiziert. Nach den HPLC-Nachweisergebnissen zeigten diese drei endophytischen Bakterien alle charakteristische Peaks zu den Zeitpunkten 15,98, 57,64 und 75,19 Minuten, was darauf hindeutet, dass mindestens drei Saponine in ihren Fermentationsprodukten die gleiche Struktur haben könnten, was weiter experimentell überprüft werden muss. Gegenwärtig gibt es zwei Hauptstrategien für den Nachweis von Steroidsaponinen: zum einen den direkten Nachweis und zum anderen den indirekten Nachweis durch qualitative und quantitative Analyse der gespaltenen Saponine. Wissenschaftler haben die HPLC-Methode verwendet, um den Dioscingehalt in Dioscorea nipponica, Pfeilwurz, Sisal und Lilienknospen zu bestimmen. In Ermangelung von Standard- und isolierten reinen Proben von Xiangmaidong-Steroidsaponinen wurden in diesem Experiment vorübergehend die vorbereiteten Steroidsaponine der Xiangmaidong-Wurzel (Mischung) als Positivkontrollen verwendet. Durch den Vergleich, ob charakteristische Peaks zum gleichen Zeitpunkt unter den gleichen Nachweisbedingungen auftreten konnten, wurden die Eigenschaften der Glykosidproduktion der endophytischen Bakterien vorläufig identifiziert. In Zukunft wird unser Labor das Fermentationsprodukt Saponin-Extrakt weiter auftrennen und reinigen und Massenspektrometrie, kernmagnetische Resonanz und andere Methoden für eine genauere Charakterisierung einsetzen.

Auf der Grundlage der DGGE-Analyse der hochvariablen Region der 16SrDNA V6 ～ V8 und in Kombination mit den Screening-Ergebnissen rein kultivierter endophytischer Bakterien, die Steroidsaponine produzieren können, wurde in diesem Experiment ein Phänomen festgestellt: Während der schnellen Expansionsphase und der reifen Erntephase der Xiangmaidong-Wurzelknollen kann mexikanisches Pseudoyellow Pseudomonas P. in den Wurzelknollen nachgewiesen werden. Es hat sich bestätigt, dass die Biomasse und der Gehalt an steroidalen Saponinen in den Wurzelknollen von Xiangmaidong vom Anfangsstadium an allmählich zunehmen und ihren Höhepunkt während des schnellen Wachstums und der Reifephase der Ernte erreichen. Bedeutet dieses Phänomen, dass Pseudomonas aeruginosa in Mexiko eine positiv korrelierte Rolle bei der Anhäufung von steroidalen Saponinen in den Knollen von Ophiopogon japonicus spielt? Auch dies muss noch experimentell überprüft werden.