Gleichzeitige Bestimmung von sechs Flavonoiden in Wuyao-Blättern durch Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie
Lindera aggregata (Sims) Kosterm, eine Pflanze aus der Familie der Kampfergewächse und der Gattung Piper, hat entzündungshemmende, schmerzlindernde, antioxidative und tumorhemmende Wirkungen. Sie wird hauptsächlich in den südöstlichen Küstenprovinzen Chinas angebaut, wobei der Kreis Tiantai in der Provinz Zhejiang der bekannteste ist, weshalb sie auch Tiantai Wuyao genannt wird. Im Jahr 2018 wurde er als eine der neuen "Zhejiang Eight Flavors" in Zhejiang ausgewählt. Die moderne pharmakologische Forschung hat gezeigt, dass die schwarze Medizin auch immunmodulatorische Wirkungen auf das zentrale Nervensystem und das Herz-Kreislauf-System hat, was ihre Marktaussichten breit macht. Die medizinischen Teile von Wuyao wachsen jedoch langsam und brauchen oft 8-10 Jahre, um die Anforderungen für eine hochwertige Heilpflanzenverarbeitung zu erfüllen. Während des Wachstumszyklus werden die Stängel- und Blattteile oft weggeworfen, was zu einer geringen Nutzung der Ressourcen führt. In den volkstümlichen Gegenden von Zhejiang werden Wuyao-Blätter häufig zur Behandlung von akuter Zellulitis, rheumatischer Arthritis und anderen Entzündungen verwendet und auch oft zu Teegetränken verarbeitet, die fettsenkend wirken, die Leber schützen und andere gesundheitliche Vorteile bieten. Frühere Studien haben gezeigt, dass Extrakte aus Wuyao-Blättern eine gewisse lipidsenkende Wirkung haben. Das Forschungsteam führte eine pharmakologische Korrelationsstudie über Wuyao-Blattextrakte durch und fand heraus, dass sie einen bestimmten Wirkmechanismus gegen Hyperlipidämie und Osteoporose haben. Gleichzeitig wurden die Wuyao-Blätter in der Anfangsphase auch systematisch von chemischen Komponenten getrennt und extrahiert. Sechs Flavonoide wurden zum ersten Mal aus dem Ethanolextrakt der Wuyao-Blätter isoliert, die wie folgt identifiziert wurden Kaempferol-3-O - α - L-Rhamnosid (1), Quercetin (2), Kaempferol-3-O - β - D-Xylosid (3), Kaempferol-3-O - α - L-Arabinofuranosid (4), Kaempferol-3-O - (2 ″ -3-O-trans-3-O-p-3-O-coumaroyl) - α - L-Rhamnosid (5), Kaempferol-3-O - (2 ″, 4 ″ -3-O-di-3-3-O-3-3-O-di-3-glucosid) O-trans-3-O-p-3-O-coumaroyl) - α - L-rhamnosid (6), chemische Struktur in Abbildung 1 dargestellt.

Gegenwärtig gibt es einschlägige Forschungsberichte über die Qualitätsbewertung von Wuyao-Blättern. Yi et al. bestimmten mittels HPLC den Gehalt von vier Flavonoiden in Wuyao-Blättern unterschiedlicher Herkunft aus der Provinz Hunan. Sun et al. bestimmten den Gesamtflavonoidgehalt in Wuyao-Blattextrakten mittels UV-Spektrophotometrie und untersuchten die für die Extraktion der Gesamtflavonoide relevanten Faktoren, um den Extraktionsprozess zu optimieren. Gleichzeitig verwendeten Sun et al. HPLC, um den Gehalt von vier sesquiterpenoiden Laktonen in Wuyao-Blättern unterschiedlicher Herkunft zu bestimmen. Dabei handelt es sich jedoch um traditionelle Nachweismethoden, denen es an hoher Effizienz und Genauigkeit bei der Inhaltsbestimmung mangelt. Mit der Weiterentwicklung der Massenspektrometrie-Technologie wurde die Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Technologie mit hoher Effizienz, hoher Spezifität und hoher Empfindlichkeit entwickelt. Die Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-MS/MS) hat sich zu einer wichtigen Analysemethode für den Nachweis der Qualität traditioneller chinesischer Heilmittel entwickelt. Daher wird in dieser Studie die UPLC-MS/MS-Technologie verwendet, um die sechs wichtigsten Flavonoide in Wuyao-Blättern unterschiedlicher Herkunft quantitativ zu untersuchen und die Entropie-Gewicht-α-L-approximale ideale Lösung-Ranking-Methode (TOPSIS) für die Analyse und Bewertung zu kombinieren, um eine wissenschaftliche Grundlage für die interne Qualitätskontrolle von Wuyao-Blättern zu schaffen.

 

Auswahl der Extraktionsbedingungen. In dieser Studie wurde die UPLC-MS/MS-Methode zur gleichzeitigen Bestimmung des Gehalts von sechs Indikatorverbindungen verwendet, nämlich Kaempferol-3-O - α - L-Rhamnosid (1), Quercetin (2), Kaempferol-3-O - β - D-Xylosid (3), Kaempferol-3-O - α - L-Arabinofuranosid (4), Kaempferol-3-O - (2" - trans - p-Coumaroyl) - α - L-Rhamnosid (5) und Kaempferol-3-O - (2", 4 "- di trans - p-Coumaroyl) - α - L-Rhamnosid (6), in Wuyao-Blättern innerhalb von 10 Minuten. Die Methanolkonzentrationen betrugen 30%, 50% bzw. 70%. Auf der Grundlage der Analyse des Spektrums wurde 70% Methanol für die beste Extraktionswirkung ausgewählt. Gleichzeitig wurde ein Vergleich zwischen der Erhitzung unter Rückfluss und der Ultraschallextraktion durchgeführt. Nach den Ergebnissen der Inhaltsstoffe waren die erzielten Extraktionsraten vergleichbar. In Anbetracht des Zeitaufwands und der Kosten für Verbrauchsmaterialien wurde die Ultraschallextraktion gewählt.
Chromatographie-Massenspektrometrie-Bedingungen. In dieser Studie wurden drei mobile Phasensysteme untersucht: Acetonitril-Wasser, Acetonitril-0,1% Ameisensäure-Wasser und Acetonitril-0,1% Ammoniumformiat-Wasser. Die Peakfläche und die Peakform von sechs Flavonoiden wurden als Bewertungsindikatoren verwendet, um das geeignete Mobilphasensystem zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass, wenn Acetonitril-Wasser als mobile Phase gewählt wurde, gab es ein Tailing-Phänomen in den Verbindungen von Kaempferol-3-O - (2 "- trans-pcoumaroyl) - α - L-rhamnosid und Kaempferol-3-O - (2", 4 "- di-trans-pcoumaroyl) - α - L-rhamnosid; Wenn Acetonitril 0.1%-Ammoniumformiat-Wasser als mobile Phase gewählt wird, zeigt Quercetin-3-O - α - L-Arabinofuranosid ein leichtes Tailing; Wenn Acetonitril 0,1%-Ameisensäure-Wasser als mobile Phase gewählt wurde, waren die Peakformen aller sechs Verbindungen relativ symmetrisch. Daher wurde Acetonitril 0,1% Ameisensäure-Wasser als mobiles Phasensystem gewählt. Bei der Auswahl der Massenspektrometriebedingungen wurden in der Studie positive und negative Ionenmodi verwendet, um den Gehalt der sechs Zielverbindungen zu bestimmen. Um sicherzustellen, dass die Zielverbindungen eine bessere Stabilität, höhere Ansprechwerte und bessere Peakformen aufweisen, haben mehrere wiederholte Experimente gezeigt, dass die sechs Flavonoidverbindungen durch die Verwendung des Negativ-Ionen-Scanning-Modus für den Nachweis stabiler sind und unter den Nachweisbedingungen bessere Peakformen und Ansprechwerte aufweisen. Gleichzeitig waren bei der Untersuchung der Chromatographie-Massenspektrometrie-Bedingungen die Retentionszeiten der Flavonoide 2 und 5, die aus dem Ionenchromatogramm in Abbildung 2 extrahiert wurden, im Wesentlichen identisch. Im Vergleich zu den traditionellen HPLC-Analysetechniken ist die Chromatographie-Massenspektrometrie, die auf der Analyse des Masse-Ladungs-Verhältnisses basiert, nicht auf die Trennung von Peak zu Peak angewiesen und verfügt über eine kurze Signalerfassungszeit und eine hohe Empfindlichkeit. Daher wurde in dieser Studie die UPLC-MS/MS-Analysetechnik zur gleichzeitigen Bestimmung von sechs Flavonoiden in Wuyao-Blättern verwendet, die weitere Vorteile bietet.
Analyse der Ergebnisse. In dieser Studie wurden medizinische Proben aus 10 Wuyao-Anbaugebieten in China gesammelt und mit Hilfe der UPLC-MS/MS-Technologie gleichzeitig der Gehalt von sechs chemischen Komponenten in Wuyao-Blättern bestimmt. Die TOPSIS-Methode mit Entropie-Gewichtung wurde verwendet, um die sechs Bestandteile aus den 10 Anbaugebieten umfassend zu analysieren und zu bewerten. Das umfassende Ranking sah wie folgt aus: Tiantai, Zhejiang>Jinhua, Zhejiang>Changsha, Hunan>Ningde, Fujian>Kunming, Yunnan>Tonglu, Zhejiang>Guilin, Guangxi>Yingtan, Jiangxi. Die Ergebnisse zeigten, dass die umfassende Qualität der Wuyao-Blätter in Tiantai, Zhejiang, relativ hoch war, was mit dem traditionellen Glauben zusammenhängt, dass Tiantai, Zhejiang, ein echtes Wuyao-Heilmittelproduktionsgebiet ist. Gleichzeitig bestätigt es auch den Eintrag im Compendium of Materia Medica, dass Tiantai bei Wuyao der Gewinner ist; im Dictionary of Traditional Chinese Medicine wird festgehalten, dass die Produktion von Wuyao in Zhejiang am größten und die Qualität der in Tiantai, Zhejiang, hergestellten Produkte am besten ist, weshalb sie "Tiantai Wuyao" oder "Tai Wuyao" genannt werden. Gleichzeitig spiegeln die Bewertungsergebnisse auch wider, dass es signifikante Unterschiede im Gehalt der sechs wichtigsten Flavonoide in Wuyao-Blättern verschiedener Herkunft gibt, und es gibt auch signifikante Unterschiede in Wuyao-Blättern aus verschiedenen Städten in derselben Provinz. Dies könnte mit den Quellen der Wuyao-Einführung in verschiedenen Anbaubasen und unterschiedlichen ökologischen Umgebungen zusammenhängen.
Derzeit ist Wuyao Ye als neues Ressourcennahrungsmittel zugelassen, so dass seine Produktentwicklung weiter erforscht werden wird. In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, die einfach zu bedienen ist, eine gute Präzision, Stabilität und Wiederholbarkeit aufweist und gleichzeitig den Gehalt von sechs Flavonoiden in Wuyao Ye bestimmen kann. Sie kann zur quantitativen Analyse und umfassenden Bewertung der wichtigsten Flavonoide in Wuyao Ye verwendet werden, und die verwendete TOPSIS-Methode mit Entropiegewicht bietet auch eine theoretische Grundlage für die Bewertung der Qualität anderer Heilkräuter mit medizinischem Wert.