Forschung zur Hochdurchsatz-Nachweismethode von Lingzhi-Ergothionein
Ergothionein (EGT), auch bekannt als 2-Thio-Lhistidin-Trimethyl-Innensalz, ist eine natürliche Aminosäure, die in vielen Tieren und Pflanzen reichlich vorhanden ist. Sie wird nur in einigen Mikroorganismen (Actinomyceten, Streptomyceten), Pilzen und bestimmten Cyanobakterien synthetisiert und kann nicht von tierischen Organismen selbst hergestellt werden. Der menschliche Körper kann EGT nur über die Nahrung aufnehmen und hohe Konzentrationen von EGT in verschiedenen Zellen und Geweben durch den hochspezifischen neuen Typ-1-Transporter für organische Kationen (OCTN1) anreichern. EGT gilt als starkes Antioxidans, und Servillo et al. untersuchten seinen antioxidativen Mechanismus, wobei sie davon ausgingen, dass es einen einzigartigen Redox-Mechanismus besitzt, und schlugen eine einzigartige antioxidative Wirkung von EGT in Zellen vor. Das Standard-Oxidations-Reduktionspotenzial von EGT beträgt -0,06 V, während das Potenzial anderer Thiole im Allgemeinen zwischen -0,32 V und -0,2 V liegt. Daher ist EGT bei physiologischen pH-Werten stabiler als andere Antioxidantien und weniger anfällig für spontane Oxidation. Die Forschung hat gezeigt, dass EGT mehrere wichtige physiologische Funktionen hat, wie z. B. entzündungshemmende Wirkungen; Zellschutzfunktion durch Schutz der DNA; antidepressive Funktion durch Förderung der neuronalen Differenzierung und Neurogenese; Augenschutzfunktion durch Widerstand gegen oxidativen Stress; Herz-Kreislauf- und zerebrovaskuläre Schutzfunktion durch Unterbrechung der Expression von Adhäsionsmolekülen, die mit Atherosklerose in Zusammenhang stehen; EGT hat aufgrund seiner präventiven und therapeutischen Wirkungen auf neurodegenerative Erkrankungen, die durch die Hemmung der Toxizität erreicht werden, und seiner inhärenten Sicherheit eine breite Palette von Anwendungsmöglichkeiten in Branchen wie Medizin, Lebensmittel und Kosmetik.

Zu den Produktionsmethoden von EGT gehören die chemische Synthese, die Extraktion von Speisepilzen und die mikrobielle Fermentation. Aufgrund der hohen Kosten und des komplexen Prozesses der beiden erstgenannten Verfahren ist die Tiefenfermentation von Speisepilzhyphen derzeit die gängigste Methode der industriellen EGT-Produktion. Natürliche Stämme haben jedoch eine geringe EGT-Produktion, und es ist notwendig, durch Zuchttechniken ertragreiche industrielle EGT-Stämme zu züchten. Zu den Methoden zur Züchtung industrieller Speisepilzstämme gehören Mutagenesezüchtung, Hybridisierungszüchtung, gentechnische Züchtung und Protoplastenfusionszüchtung. Jede Züchtungsmethode erfordert jedoch mehrere groß angelegte Tests zum EGT-Gehalt. Es sollte beachtet werden, dass die Bedeutung der EGT-Gehaltstests im Züchtungsprozess eher darin besteht, den Gehalt zwischen verschiedenen Proben zu vergleichen. Zu den derzeitigen Nachweismethoden für EGT gehören Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Hochleistungskapillarelektrophorese und Dünnschichtelektrophorese. Die am weitesten verbreitete Methode ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie, mit der der EGT-Gehalt in komplexen Materialsystemen genau nachgewiesen werden kann. Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie hat jedoch offensichtliche Mängel, d. h. es müssen unterschiedliche Nachweisbedingungen für verschiedene Proben untersucht werden. Aufgrund der späten Peakzeit von EGT und der teuren Standardproben kann das Screening von Proben mit hoher Ausbeute aus einer großen Anzahl von Proben in der Zucht zu langen Nachweiszeiten und hohen Kosten führen, was die Entwicklung und Anwendungsforschung von EGT stark behindert. Daher ist es dringend erforderlich, ein schnelles Hochdurchsatz-Nachweisverfahren zu entwickeln, mit dem die EGT-Konzentration zwischen den Proben genau bestimmt werden kann.
Aufgrund seiner starken antioxidativen Eigenschaften und seiner mäßigen Reduzierbarkeit zu zweiwertigen Eisenionen (die weder durch den Kontakt mit Luftsauerstoff beeinträchtigt noch aufgrund der schwachen Reduzierbarkeit reduziert werden) kann EGT mit zweiwertigen Eisenionen reagieren und farblose Chelate bilden, während Thiocyanat-Ionen mit zweiwertigen Eisenionen reagieren und rote Komplexe bilden. Aufgrund dieser Eigenschaften wurde in dieser Studie Eisen-Thiocyanat als Reduktionsmittel ausgewählt, und der Ergotamin-Standard wurde zur Reaktion mit Eisen-Thiocyanat verwendet, um ein Hochdurchsatz-Nachweissystem für Ergotamin zu etablieren. Gleichzeitig wurde das Hochdurchsatz-Nachweissystem durch Variation der EGT-Ausbeuten verschiedener Ganoderma lucidum-Stämme validiert. Die Ergebnisse dieser Studie werden neue Methoden und Ideen für das Screening von ertragreichen EGT-Mikroorganismen und die Züchtung neuer ertragreicher EGT-Stämme liefern.

Aufgrund der stark reduzierenden physikalisch-chemischen Eigenschaften von Ergothionein wurden vor der Konstruktion des EGT-Thiocyanat-Eisen-Systems Versuche zur Konstruktion des alkalischen Kaliumpermanganat-Systems, des Bromkresolgrün-Systems, des blauen Flaschen-Methylenblau-Systems, des Guajakol-Systems und des Eisenchlorid-EGT-Systems durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das alkalische Kaliumpermanganat-System aufgrund der geringen Stabilität scheiterte; die Farbentwicklung des Bromkresolgrün-Systems scheiterte aufgrund der pH-Abhängigkeit; im blauen Flaschen-Methylenblau-System wird es aufgrund der starken Reduzierbarkeit des reduzierten Zustands von Methylenblau auch leicht zu Methylenblau oxidiert, wenn es mit Luftsauerstoff in Berührung kommt, was zum Scheitern des Experiments führt, ohne dass ein Phänomen auftritt; das Guajakol-System scheiterte ebenfalls aufgrund der starken Reduzierbarkeit und der Störung durch den Sauerstoffkontakt; das Eisenchlorid-System scheiterte aufgrund der geringen Farbwiedergabe. Das EGT-Eisenthiocyanat-System kann für die Untersuchung von Hochdurchsatz-Nachweisverfahren für EGT verwendet werden.

Bei der Konstruktion des EGT-Thiocyanat-Eisennachweissystems wurde festgestellt, dass Rückstände von phenolischen Substanzen in der Extraktionslösung die Farbreaktion des Systems beeinträchtigen und seine Empfindlichkeit verringern würden, wenn die untersuchte Probe mit der üblichen EGT-Rohextraktionsmethode extrahiert wird, nämlich mit Alkoholausfällung und Stickstoffblasen bei konstantem Volumen. Daher muss der Rohextraktionslösung nach der Stickstoffblasextraktion mit konstantem Volumen ein Schritt zur Entfernung von Chloroformphenol hinzugefügt werden.
Ganoderma lucidum ist ein traditioneller und wertvoller Heilpilz in China, der verschiedene bioaktive Substanzen und physiologische Funktionen enthält. Sein Gehalt an Ergotionein ist unter den vielen Speisepilzen relativ hoch, aber als kommerziell produzierter Stamm ist sein Ertrag immer noch gering. Daher ist die Züchtung eines neuen Stammes von Ganoderma lucidum mit hoher Ergothionein-Produktion von großer Bedeutung und praktischem Nutzen. Aus den oben genannten Gründen hat unser Labor eine Reihe von Pseudofusionsprodukten durch Protoplastenfusionsregeneration, Isolierung und Identifizierung gewonnen. Die Ganoderma lucidum-Fusionsprodukte, die bei der Validierung dieser Methode verwendet wurden, stammen alle aus dieser Quelle.
Die in dieser Studie entwickelte Methode basiert auf den physikalischen und chemischen Eigenschaften von EGT selbst, und das Nachweissystem ist empfindlich und stabil. Es eignet sich für den schnellen Vergleich großer Mengen von Proben im Züchtungsprozess von EGT produzierenden industriellen Fermentationsstämmen. Theoretisch ist nur eine einfache Optimierung der EGT-Probenextraktion erforderlich, um einen schnellen Hochdurchsatz-Nachweis des EGT-Gehalts in der großen Mehrheit der Stämme zu erreichen. Damit werden die Grenzen der ursprünglichen EGT-Forschung überwunden und neue Methoden und Ideen für die allgemeine Entwicklung und Anwendungsforschung von EGT bereitgestellt.