Studie über die Förderung der inkrementellen Anreicherung von Huperzin A durch eine symbiotische Kultivierungsmethode
Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) ist eine Farnpflanze aus der Familie der Taxaceae, die zur Gattung Taxodium gehört. Es handelt sich um ein seltenes chinesisches pflanzliches Arzneimittel, das zur Behandlung von traumatischen Verletzungen, zur Entgiftung, zur Schmerzlinderung und zur Behandlung von Schizophrenie eingesetzt wird. Die Schlangenfußtanne ist derzeit eines der am besten erforschten Medikamente zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit. Ihr Wirkstoff, Huperzin A, ist ein effizienter, wenig toxischer, reversibler und hochselektiver Acetylcholinesterase (AChE)-Hemmer zur Behandlung von Myasthenia gravis und Alzheimer. Es kann die Wirkung von Acetylcholin verstärken, einem Neurotransmitter des Zentralnervensystems, der mit Aufmerksamkeit, Wachsamkeit, Konzentration und Gedächtnis zusammenhängt. Im Jahr 1982 wurde Huperzin A erfolgreich aus der Schlangenfußtanne isoliert und galt als "Stern der Hoffnung". Einer Studie zufolge wird die Zahl der Alzheimer-Patienten im Alter von 65 Jahren und darüber in den Industrieländern bis 2025 auf 7,1 Millionen ansteigen, was einem Anstieg von fast 29% gegenüber 5,5 Millionen im Jahr 2018 entspricht. Wenn es keinen medizinischen Durchbruch gibt, könnte die Zahl der Patienten mit dieser Krankheit bis 2050 von 5,5 Millionen auf 13,8 Millionen ansteigen. Allein in den Vereinigten Staaten leiden etwa 14-20 von 100000 Menschen an Myasthenia gravis, was einer Gesamtzahl von etwa 36000-60000 Patienten entspricht, was ebenfalls eine sehr alarmierende Zahl ist. Das größte Problem bei den derzeit auf dem Markt befindlichen Medikamenten zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit und der Myasthenia gravis ist die Toxizität und die Resistenz gegen das Medikament. Im Vergleich zu den derzeitigen Medikamenten ist Huperzin A ein natürlicher Pflanzenextrakt mit guter Sicherheit, weniger Nebenwirkungen und kann schnell vom menschlichen Körper aufgenommen werden. Die Hemmungsmethode ist eine gemischte Art von kompetitiver und nicht kompetitiver Hemmung, und die therapeutische Wirkung ist signifikant mit einer langen Wirkungsdauer.
Die schlangenfüßige Cryptomeria ist weltweit verbreitet, aber ihre Ressourcen sind sehr begrenzt. Ein einschränkender Faktor ist das langsame Wachstum der Schlangenfuß-Kryptomerie, die von den Sporen bis zur Reife mindestens 15 Jahre benötigt. Und im reifen Stadium ist die Schlangenfußtanne nur 10-30 cm hoch. Gleichzeitig sind die Wachstumsbedingungen nur schwer nachzubilden und im tatsächlichen Anbauverfahren schwer zu fördern. Daher wird die Schlangenfußtanne in naher Zukunft vom Aussterben bedroht sein. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Studien über diese seltene Pflanze durchgeführt, z. B. die In-vitro-Kultivierung von Explantaten und Kallusgewebe. Das Team von Kan'ichiro Ishiuchi hat sukzessive mit H Die Explantate wurden aus der Stammspitze der Pinifolia gewonnen und in sterilem Medium für 2 Zyklen (jeder Zyklus dauert 7 Tage) kultiviert. Schließlich wurden die Explantate erfolgreich in das Kalluswachstumsmedium übertragen. Darüber hinaus haben die Forscher verschiedene Verbesserungen an der Kulturmethode von Huperzia serrata vorgenommen, wie z. B. das Screening von Mediumkomponenten und die Erforschung der Stammspitzenkulturtechnik. Das Problem der Desinfektion und Sterilisation der Explantate bei der Gewebekultur wurde jedoch nicht wirksam gelöst, was die großtechnische Produktion von Huperzin A einschränkt. Aufgrund der Knappheit der natürlichen Ressourcen und der oben genannten Gründe ist es dringend erforderlich, eine neue Methode zu finden, die den Gehalt an Huperzin A zu geringeren Kosten erhöhen kann.
Endophytische Pilze sind eine Art von Pilzen, die im Gewebe von Pflanzenstängeln und -blättern leben. Studien haben ergeben, dass endophytische Pilze, wenn sie sich über einen längeren Zeitraum in Symbiose mit Pflanzen entwickeln, durch genetische Rekombination bestimmte Gene der Wirtspflanze übernehmen und Sekundärmetaboliten produzieren können, die denen der Wirtspflanze entsprechen. Gleichzeitig können endophytische Pilze auch Hormone produzieren, die das Wachstum und die Entwicklung der Wirtspflanzen fördern. Daher werden endophytische Pilze im Co-Kultursystem als Elicitoren betrachtet, was bedeutet, dass Pflanzenzellen innerhalb eines bestimmten Konzentrationsbereichs mit endophytischen Pilzen co-kultiviert werden können. Im Co-Kultursystem interagieren endophytische Pilze und Pflanzenzellen miteinander und fördern die Akkumulation von Pflanzenprodukten. Ergosterol ist ein wichtiger Bestandteil der Pilzzellmembran und ein charakteristisches Sterol von Pilzen. Es kann als repräsentativer Indikator zur Messung der Pilzbiomasse verwendet werden.
In dieser Studie wird ein neuartiges Co-Kultursystem (CCS) vorgestellt, mit dem sich der Huperzin-A-Gehalt der chinesischen Tanne auf wirtschaftliche und bequeme Weise erhöhen lässt, um die derzeitige Situation zu verbessern, in der die chinesische Tanne aufgrund der Ressourcenknappheit nicht in großem Umfang genutzt werden kann.

Huperzin A ist ein AChE-Hemmer, der zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit und der Myasthenia gravis eingesetzt wird. Seine Hauptquelle ist Cryptomeria lanceolata, aber der Gehalt an Huperzin A in Cryptomeria lanceolata ist gering, und die begrenzten Ressourcen von Cryptomeria lanceolata begrenzen seine weitere Entwicklung im pharmazeutischen Bereich. Es gibt Studien, die zeigen, dass es verschiedene endophytische Pilze in Pflanzen gibt, die im Laufe der langfristigen Evolution eine komplexe wechselseitige Beziehung mit ihren Wirtspflanzen eingegangen sind. Einerseits müssen endophytische Pilze Nährstoffe aus Pflanzen aufnehmen, um ihren eigenen Lebensbedarf zu decken. Andererseits stehen endophytische Pilze in einer speziellen biochemischen Kommunikation mit den Wirtspflanzen, um dem Abwehrsystem des Wirts zu widerstehen. Sie können Sekundärmetaboliten synthetisieren, die denen des Wirts ähnlich sind, indem sie die chemischen Signale des Wirts erkennen oder Enzymsysteme des Wirts nutzen. Jiang et al. isolierten und reinigten endophytische Pilze aus der halbroten Mangrovenpflanze Hibiscus und gewannen durch Festphasenfermentation die gleichen Sekundärmetaboliten wie der Wirt. Tong et al. isolierten und untersuchten die Sekundärmetaboliten des endophytischen Pilzes FS4 in Cryptomeria serrata und fanden heraus, dass seine fünf Metaboliten eine starke hemmende Acetylcholinesterase-Aktivität aufweisen, die der von Huperzin A ähnelt.
In dieser Studie wurden Experimente zu den Domestikationsbedingungen und den Bedingungen des Gewebekulturmediums von wildem Schlangenfußschierling durchgeführt. Als optimale Kulturbedingungen wurden eine Lichtintensität von 100 Lux, eine Luftfeuchtigkeit von 95%, MS-Flüssigmedium, Saccharose von 20,0g/L, 2,4-D5,0mg/L und KT1,0mg/L ermittelt. Die relativen Veränderungen von zwei Verbindungen, Huperzin A und Ergosterol, wurden verwendet, um den dynamischen Wachstumsprozess von CCS widerzuspiegeln. Der vierte Tag wurde aufgrund seines Wendepunkts als optimaler Zeitpunkt für die Ernte und Subkultur festgelegt. Nach 4 Tagen Kultivierung mit CCS stieg der Gehalt an Huperzin A um 49,34% und erreichte seinen Höchstwert. Der Gesamtgehalt an Huperzin A im Kultursystem zeigte einen Trend, der zunächst anstieg und dann abnahm. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die endophytischen Pilze in der späteren Wachstumsphase eine stärkere Vermehrungsfähigkeit haben als die Differenzierungsfähigkeit der Pflanzenzellen und um Nährstoffe und Wachstumsraum im Kulturmedium konkurrieren, was zu einem Rückgang der Zellzahl führt. Daher ist die Wahl des Ernte- und Subkulturzeitpunkts der Schlüssel zum Erreichen einer schrittweisen Anreicherung von Huperzin A im Co-Kultursystem. Gleichzeitig hat die Konzentration des Pflanzenhormons 2,4-D einen erheblichen Einfluss auf das System. 2,4-D fördert die Entdifferenzierung von Pflanzenorganen und die Induktion von Kallusgewebe, hat aber bei einer zu hohen Konzentration eine hemmende Wirkung auf die Zelldifferenzierung. Daher wird in dem Kultursystem 5mg/L als optimale Konzentration verwendet. In diesem Experiment wurde erfolgreich ein Co-Kultursystem für die Biosynthese von Huperzin A eingesetzt. Diese Methode überwindet die traditionellen starren Konzepte, da die Kultur somatischer Pflanzenzellen keine vorherige gründliche Sterilisation erfordert. Pflanzliche somatische Zellen und endophytische Pilze können gemeinsam kultiviert werden, und die Produktion von Huperzin A kann in bestimmten Verhältnissen gefördert werden. Solange der Kultivierungszyklus genau erfasst wird, kann diese bequeme und schnelle Methode zur Akkumulation von Huperzin A verwendet werden, was für den Schutz der pflanzlichen Ressourcen und die Anreicherung der wichtigen bioaktiven Substanzen von Huperzin A von großer Bedeutung ist.