Schützende Wirkung von Chitosan-Oligosacchariden auf Dextransulfat-induzierte Kolitis bei Mäusen
Zu den entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) gehören Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD). Die Colitis ulcerosa wurde 1875 von Wilk und Moxon entdeckt, 1903 von Boas und Wilk definiert und 1905 von der WHO offiziell als besondere klinische Erkrankung bezeichnet. Bei der Colitis ulcerosa handelt es sich um eine unspezifische Kolitis, die hauptsächlich im Colon sigmoideum und Rektum des Dickdarms auftritt. Die Läsionen sind kontinuierlich in der Mukosa und Submukosa verteilt und rezidivieren langsam. Es gibt auch einige wenige Fälle mit akutem Beginn, die sich hauptsächlich durch Bauchschmerzen, Durchfall und klebrigen Stuhl mit Eiter und Blut äußern, begleitet von verschiedenen extraintestinalen Symptomen. Die genaue Ätiologie und Pathogenese der Colitis ulcerosa sind noch immer unklar, und es wird allgemein angenommen, dass sie mit verschiedenen Faktoren wie Infektionen, Störungen des Immunsystems, genetischer Empfindlichkeit, Umwelt, psychischem Zustand und Dysbiose zusammenhängt. In den westlichen Ländern ist sie sehr verbreitet, wobei auf 105 Menschen 10 bis 20 Betroffene kommen, wobei die Inzidenzrate in Nordamerika und Westeuropa höher ist. In den letzten Jahren hat die Häufigkeit von UC auch in China zugenommen. Derzeit stehen symptomatische Medikamente wie 5-Aminosalicylsäure (Sulfasalazin) und Immunsuppressiva für die Behandlung der Kolitis zur Verfügung, die jedoch bestimmte Nebenwirkungen haben, so dass die Suche nach sicheren Medikamenten ein Forschungsschwerpunkt ist.
Chitooligosaccharide (COS) werden durch Hydrolyse von Chitosan (CS) hergestellt, mit einem Polymerisationsgrad von 2-20 und einem durchschnittlichen Molekulargewicht von weniger als 3900 Da. Ihr Molekulargewicht ist gering, sie sind leicht wasserlöslich und können direkt von biologischen Organismen aufgenommen werden. Es hat biologische Aktivitäten wie Fettabbau, Senkung des Blutzuckerspiegels, Hemmung von Bakterien, Krebsbekämpfung und Entzündungshemmung und hat keine toxischen Nebenwirkungen. Es kann in verschiedenen Bereichen wie Medizin, Kosmetik, Lebensmittel und Landwirtschaft eingesetzt werden. Chitosan wird durch Deacetylierung von Chitin gewonnen, dem nach Zellulose zweithäufigsten Polymer der Welt (das häufig in Schalen von Krebstieren, der Epidermis von Insekten und den Zellwänden von Pilzen vorkommt). Derzeit gibt es einige Studien über die Wirkung von Chitosan-Oligosacchariden auf Colitis, wie z. B. die Entdeckung von Yang et al., dass Chitosan-Oligosaccharide durch AMPK und NF-κ B eine schützende Wirkung auf Colitis erzielen können. Die Anwendungskonzentration ist jedoch deutlich höher (in der Regel 500 mg/kg, was einer menschlichen Dosis von etwa 3,6 g entspricht) und liegt weit über der national empfohlenen Aufnahmemenge von 0,5 g/Tag (siehe Bekanntmachung über die Zulassung von sechs neuen Lebensmittelzutaten, darunter Chitosan-Oligosaccharide (2014 Nr. 6), was einer Mausdosis von 70 mg/kg entspricht). Yousef fand heraus, dass Chitosan-Oligosaccharide in einer Dosis von 20 mg/kg auch eine schützende Wirkung auf die Kolitis haben können, indem er ein Essigsäure-Infusionskolitis-Modell und Experimente mit Darmepithelzellen verwendete. Daher wird in diesem Artikel hauptsächlich ein 3% DSS trinkwasserinduziertes Colitis-Mausmodell verwendet, um die Wirkung von Chitosan-Oligosacchariden auf Colitis in verschiedenen Dosen (70 und 140 mg/kg) zu überprüfen, die Rolle von Chitosan-Oligosacchariden bei der Regulierung von Colitis-Symptomen und des physiologischen Status bei Mäusen zu erforschen und Daten für die weitere Erforschung der schützenden Wirkung von Chitosan-Oligosacchariden auf DSS-induzierte Colitis-Mäuse bereitzustellen. In diesem Experiment wurden 50 männliche C57BL/6-Mäuse nach dem Zufallsprinzip in 5 Gruppen eingeteilt: die Blindgruppe, die Modellgruppe, die Positivgruppe (SASP, 50 mg/kg) und die niedrig- und hochdosierten Chitosangruppen (70 und 140 mg/kg), indem sie 7 Tage lang Wasser mit 3% Natriumdextransulfat (DSS) tranken, um ein Modell zu erstellen. Bewertung der Wirkung von Chitooligosacchariden anhand von Gewichtsveränderungen, Krankheitsaktivitätsindex, pathologischem Score und Myeloperoxidase-Aktivität. Bestimmung der Konzentrationen von Entzündungsfaktoren bei Kolitis mittels ELISA.

Das DSS-Kolitismodell ist ein international anerkanntes und weit verbreitetes experimentelles UC-Tiermodell, das 1990 eingeführt wurde. Zu den pathologischen Veränderungen gehören die Bildung von Geschwüren, Kryptenabszessen, Entzündungen der kleinen Gefäße, ein Rückgang der Becherzellen und die Infiltration verschiedener Entzündungszellen, die den klinischen Symptomen der menschlichen Kolitis ähneln. Die vom Land empfohlene Chitosan-Dosis für den Menschen beträgt 0,5 g/Person, was auf eine Mausdosis von 70 mg/kg umgerechnet wird. Daher haben wir anhand dieses Modells zwei Chitosan-Dosen, 70 mg/kg und 140 mg/kg, ausgewählt, um ihre Wirkungen auf die durch DSS ausgelöste Kolitis zu untersuchen. In der koreanischen Literatur wurden Experimente zur akuten Toxizität von Oligosacchariden durchgeführt und festgestellt, dass die LD50 von Oligosacchariden bei Mäusen über 5,0 g/kg liegt. Die von Zhao et al. durchgeführte Sicherheitsbewertung von funktionellen Chitosan-Lebensmitteln zeigte, dass innerhalb von 10 Tagen nach der Verabreichung an Mäuse (1,25 g/kg/Tag) und Ratten (1,47 g/kg/Tag) keine akuten toxischen Reaktionen beobachtet wurden (etwa das 312-368-fache der klinisch empfohlenen Dosis). In diesem Versuch wurde ein Modell für Colitis ulcerosa entwickelt, indem die Mäuse 7 Tage lang frei 3% DSS trinken durften. Am sechsten Tag des Versuchs wurden bei den Mäusen der Modellgruppe typische physiologische Symptome der Kolitis beobachtet, wie Gewichtsverlust, Appetitlosigkeit, unregelmäßige Behaarung, Durchfall, klebriger Kot mit Blut und sogar rektale Blutungen. Am achten Tag der Sektion wurde festgestellt, dass der Dickdarm der Modellgruppenmäuse verkürzt und das Dickdarmgewebe verstopft und ödematös war. Die HE-Färbung zeigte ein Ödem der Dickdarmschleimhaut, unvollständige Epithelzellen, das Verschwinden der Drüsenstruktur der Krypta und eine starke entzündliche Infiltration. Bei Mäusen, die mit einer niedrigen (70 mg/kg) und einer hohen (140 mg/kg) Chitosan-Dosis behandelt wurden, verbesserten sich die genannten Symptome. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Yousef et al. wies er darauf hin, dass Chitosan-Oligosaccharide die Apoptose von Darmepithelzellen verringern, Entzündungen hemmen und die strukturelle und funktionelle Integrität der Darmepithelbarriere schützen können. Einige Studien deuten darauf hin, dass entzündliche Darmerkrankungen durch Defekte in der intestinalen Epithelbarriere und eine Dysregulation der mukosalen Immunantwort verursacht werden. Chitosan-Oligosaccharide können Darmepithelzellen schützen, was auf ihre wichtige Schutzfunktion bei Enteritis hinweist. In diesem Experiment zeigte die Chitosan-Gruppe mit einer Dosis von 70 mg/kg im Vergleich zur Modellgruppe signifikante Unterschiede bei der Verbesserung der Dickdarmverkürzung, der Linderung des Ödems der Dickdarmschleimhaut und dem Schutz der Becherzellen und Kryptenstrukturen. Die Gruppe mit einer Dosis von 140 mg/kg zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied bei der Verbesserung der Dickdarmverkürzung im Vergleich zur Modellgruppe und nur einen signifikanten Unterschied bei der Verbesserung der pathologischen Gewebescores. Dies deutet darauf hin, dass die niedrig dosierte Chitosangruppe eine bessere Schutzwirkung auf DSS-induzierte Colitis bei Mäusen hat. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Dosis von 70 mg/kg Chitosan eine gewisse Wirkung auf die Linderung der Dickdarmverkürzung und den Schutz der Dickdarmstruktur bei Mäusen hatte, was für die Entwicklung und Anwendung von Chitosan in der national empfohlenen Dosis hilfreich ist.

Gegenwärtig sind die wichtigsten Behandlungsansätze für CED oxidativer Stress und Entzündungen. Es wird angenommen, dass oxidativer Stress die pathogene Grundlage der IBD ist und dass übermäßige freie Sauerstoffradikale ein Schlüsselfaktor bei der Entstehung von ulzerativen entzündlichen Gewebeschäden und Kolitis sind. Mit der Produktion von MDA erzeugt ein Überschuss an NO freie Sauerstoffradikale, die oxidative Schäden verursachen und zur Infiltration einer großen Anzahl von Entzündungszellen in das Gewebe führen. Neutrophile sind die schnellsten Immunzellen, die in den frühen Stadien der UC an den Ort der Entzündung rekrutiert werden. Sie haben eine Doppelfunktion. Einerseits aggregieren sie in den Epithelkrypten und Darmhöhlen und sezernieren IL-1, IL-6, MPO usw., indem sie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) freisetzen und so weitere Gewebeschäden verursachen. Andererseits hält es aktiv die Gewebehomöostase aufrecht, indem es entzündungshemmende Faktoren ausschüttet und die mikrobielle Invasion einschränken kann. Qiao et al. fanden heraus, dass Chitosan-Oligosaccharide die Infiltration von Neutrophilen und die Lipidperoxidation in geschädigten Organen in LPS-induzierten Sepsis-Mausmodellen reduzieren können. Dou et al. fanden heraus, dass Chitosan-Oligosaccharide die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, die Degranulation und die Adhäsion aktivierter Neutrophiler in Kaninchen hemmen und dadurch entzündungshemmende Wirkungen ausüben können. Der Wert der Myeloperoxidase (MPO) ist ein Marker für Gewebeschäden und die Infiltration von Neutrophilen (PMN), die zu Schleimhautrissen und Geschwüren führen kann, und steht in engem Zusammenhang mit CED.

Im Experiment war die MPO-Aktivität in der Colitis-Modellgruppe im Vergleich zur Blindgruppe deutlich erhöht, was auf eine signifikante Zunahme der Neutrophilen im Darmgewebe und eine starke Infiltration hinweist. Nach der Behandlung mit Chitosan-Oligosacchariden ging die MPO-Aktivität im Darmgewebe zurück, obwohl sie sich nicht signifikant von der Modellgruppe unterschied, was auf eine Verlangsamung der Neutrophilen-Aggregation im Darm und eine Verringerung weiterer Gewebeschäden hindeutete. Dies stimmt mit der Entdeckung von Dou et al. überein, dass Chitosan-Oligosaccharide die Apoptose der Neutrophilen fördern und die MPO-Freisetzung bei Mäusen mit Glykogenperitonitis verringern können. Es wird spekuliert, dass dies mit der Aktivierung von PLD und PI3K zusammenhängen könnte, die die neutrophile Produktion von Superoxid und anderen Substanzen induzieren.

Die UC ist das Ergebnis des Zusammenwirkens mehrerer Faktoren, unter denen auch Zytokine eine wichtige Rolle spielen. IL-6 kann bei niedrigen Konzentrationen die T-Zell-Proliferation stimulieren, bei hohen Konzentrationen die B-Zell-Proliferation aktivieren, Antikörper sezernieren und an der Entzündungsreaktion des Körpers teilnehmen. TNF-α， Auch bekannt als Tumor-Nekrose-Faktor alpha, wird von aktivierten Makrophagen II-Monozyten produziert und fördert die Apoptose. IL-6 und TNF-α, zwei wichtige Entzündungszytokine, sind die schnellsten und wichtigsten Entzündungsfaktoren, die auf pathogene Reize im Körper reagieren. Sie werden häufig bei verschiedenen pathologischen Prozessen wie Immunerkrankungen, Entzündungsreaktionen und Tumorimmunität gefunden. Im Dickdarmschleimhautgewebe von UC-Patienten ist die Expression von IL-6 und TNF-α in der aktiven Phase viel höher als in der Remissionsphase, und sie spielen auch eine wichtige Rolle bei der Entzündung und der Immunantwort der Darmschleimhaut und gelten als Schlüsselzytokine, die IBD vermitteln. Der Nuklearfaktor Kappa B (NF-κ B) ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der mit der Expression von Entzündungszytokinen zusammenhängt. Wenn der Körper stimuliert wird, kann I κ B aktiviert und abgebaut werden, wodurch NF - κ B im Zytoplasma aktiviert wird und in den Kern eindringt, die Gentranskription induziert und verschiedene Entzündungs- oder Chemokine wie IL-1 β, IL-6, IL-12 und TNF - α erzeugt, die durch Rückkopplungsverstärkung weiter verstärkt werden. Youself et al. gehen davon aus, dass Chitooligosaccharide die Entzündungsreaktionen im Körper lindern, indem sie den NF - κ B-Weg hemmen. In diesem Experiment war die Expression von IL-6 und TNF-α im Dickdarmgewebe von Mäusen mit Colitis ulcerosa signifikant erhöht, während die Intervention mit niedrigen und hohen Dosen von Chitosan-Oligosacchariden ihre Expressionsniveaus signifikant reduzieren konnte, was mit den Ergebnissen von Yang und Youself et al. übereinstimmt und darauf hindeutet, dass Oligosaccharide die Colitis-Symptome durch Linderung der Entzündungsreaktionen wirksam verbessern können.

Der Vergleich der experimentellen Ergebnisse zweier Dosen von Chitosan-Oligosacchariden ergab, dass beide Dosen von Chitosan-Oligosacchariden den DSS-induzierten Gewichtsverlust und die Verkürzung des Dickdarms verlangsamen und den Krankheitsaktivitätsindex hemmen sowie die MPO-Aktivität erhöhen. Sie verbesserten signifikant die histopathologischen Veränderungen und erhöhten die TNF-α- und IL-6-Werte im Gewebe. Die niedrig dosierte Gruppe und die hoch dosierte Gruppe hatten eine bessere Wirkung bei der Verringerung der Kolonlänge und der histopathologischen Veränderungen. Dies deutet darauf hin, dass die niedrig dosierte Gruppe von COS eine bessere Wirkung bei der Linderung von Colitis-Symptomen hat. Yousef et al. behandelten Colitis-Mäuse mit COS in Dosen von 1, 5, 10, 20, 50 und 100 mg/kg und stellten fest, dass 10 und 20 mg/kg COS die beste Wirkung hatten. Ähnliche glockenförmige Beziehungen zwischen der COS-Dosis und der Wirkung wurden auch bei T84-Zellen beobachtet, die durch LPS und TNF-α induziert wurden, was darauf hindeutet, dass COS zwei verschiedene Signalwege stimulieren, entgegengesetzte Wirkungen hervorrufen und einen funktionellen Antagonismus verursachen kann. Der Zusammenhang zwischen Dosis und Wirkung wurde auch in früheren Studien in unserem Labor festgestellt. Ding verabreichte Mäusen mit alkoholischer Fettleber COS in Dosen von 35, 70, 140 und 210 mg/kg und stellte fest, dass die Gruppen mit 70 und 140 mg/kg eine bessere Schutzwirkung hatten. Die in diesem Artikel ausgewählten 70 und 140 mg/kg COS können in der Mitte und im hinteren Teil der Glocke liegen, und die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Gruppe mit niedriger Dosis eine etwas bessere Wirkung hat als die Gruppe mit hoher Dosis.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Chitosan-Oligosaccharide die DSS-induzierten Kolitis-Symptome wirksam lindern können. Unter ihnen sind 70 mg/kg Chitosan-Oligosaccharide bei der Linderung der Kolonlänge und der histopathologischen Veränderungen wirksamer als 140 mg/kg und eignen sich besser als empfohlene Dosierung für den menschlichen Gebrauch. In der Zwischenzeit könnten Chitosan-Oligosaccharide eine Rolle bei der Verringerung von Entzündungen und der Linderung von IBD-Symptomen spielen, indem sie die Infiltration von Neutrophilen verringern und die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen hemmen. Der spezifische Wirkmechanismus von Chitooligosacchariden bei der Hemmung der Freisetzung von Entzündungszytokinen muss jedoch noch weiter überprüft werden.