Vorläufige Studie über die schützende Wirkung von Icariin, das den Nrf2-Signalweg aktiviert, gegen D-Galaktose-induzierte Verletzungen in Sertoli 15P-1-Zellen im Hoden der Maus
Mit der kontinuierlichen Entwicklung von Wirtschaft und Gesellschaft und dem zunehmenden Druck auf das Überleben der Menschen ist Unfruchtbarkeit zu einem globalen Problem geworden. Untersuchungen haben ergeben, dass etwa 15% der Paare weltweit an Unfruchtbarkeit leiden, wobei etwa 50% auf männliche Faktoren zurückzuführen sind und der Mechanismus noch nicht vollständig verstanden ist. Die Sertoli-Zellen des Hodens sind die einzigen somatischen Zellen, die mit den spermatogenen Zellen in Verbindung stehen. Sie umgeben strukturell die spermatogonialen Stammzellen, die Spermatogonien und die verschiedenen Ebenen der spermatogenen Zellen und bilden durch verschiedene Tight-Junction-Proteine wie Occludin und Claudin-1 eine Blut-Hoden-Barriere. Die Forschung hat gezeigt, dass die Hodenstützzellen verschiedene Wachstumsfaktoren wie den glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF), das bone morphogenetic protein-4 (BMP4) und den stem cell factor (SCF) absondern, die die Vermehrung und Differenzierung der spermatogonialen Stammzellen regulieren und die Spermienbildung fördern. In einer anderen Studie wurde festgestellt, dass bei männlichen Ratten, die während der Schwangerschaft sechswertigem Chrom ausgesetzt waren, die Expression der Tight-Junction-Proteine Occludin und Claudin-1 in den Stützzellen im Erwachsenenalter herunterreguliert wurde, was zu einer erhöhten Apoptose der spermatogenen Zellen und einer beeinträchtigten Spermienproduktion führte. Bei Hitzestress werden die Sertoli-Zellen im Hoden von Rindern geschädigt, und die mRNA-Spiegel von GDNF und SCF werden herunterreguliert, was zu einer Funktionsstörung der Spermien führt. Daher könnte die Verbesserung der Struktur und Funktion der Stützzellen ein neuer Weg zur Behandlung männlicher Unfruchtbarkeit sein.

Epimedium ist eine traditionelle chinesische Heilpflanze mit nährenden Eigenschaften, die erstmals im "Shennong Bencao Jing" beschrieben wurde. Es wirkt tonisierend auf das Nieren-Yang, stärkt Muskeln und Knochen und vertreibt Wind und Feuchtigkeit. Die moderne pharmakologische Forschung hat gezeigt, dass Epimedium erhebliche Auswirkungen auf die Verzögerung des Alterns und die Verbesserung der männlichen Fortpflanzungsfunktion hat. Sein Hauptwirkstoff ist Ikariin (ICA). Studien haben ergeben, dass ICA die Proliferation von primären Sertoli-Zellen bei Ratten fördern und die Funktion der männlichen Sertoli-Zellen verbessern kann. Die Forschung hat gezeigt, dass ICA die Fortpflanzungsfunktion von Ratten verbessern kann, indem es die mRNA-Expressionsniveaus von follikelstimulierenden Hormonrezeptoren und des Tight-Junction-Proteins Claudin-11 in den Stützzellen erhöht und dadurch die antioxidative Stressresistenz des Hodengewebes verbessert. Der Nuclear Factor Erythroid Like 2 (Nrf2), als Hauptregulator des zellulären Abwehrsystems des Körpers, reguliert die Expression einer Reihe von Genen, die für antioxidative Proteine und Proteine, die auf oxidativen Stress reagieren, kodieren, indem er sich an Enhancer-Sequenzen in der regulatorischen Promoter-Region von Antioxidant Response Elements (ARE) bindet, die Feinabstimmung der Reaktionen auf verschiedene Stressbedingungen und schädliche Angriffe koordiniert und eine Homöostase der zellulären Mikroumgebung erreicht. Die Forschung hat herausgefunden, dass Epimedium die durch oxidativen Stress verursachten Leberschäden durch die Aktivierung von Nrf2 lindern kann. Unsere früheren Forschungen haben ergeben, dass ICA die DNA-Schäden in den Hodenkeimzellen von natürlich alternden Ratten durch die Hochregulierung von Nrf2 lindern kann. ICA kann die Proteinexpression der Tight Junction-Proteine Occludin und Claudin-1 in der durch D-Gal induzierten Hodenstützzelllinie TM4 der Maus hochregulieren. Allerdings gibt es derzeit keinen Forschungsbericht darüber, ob ICA die durch D-Gal induzierten 15P-1-Zellschäden durch den Nrf2-Signalweg verbessern kann. Frühere Studien haben gezeigt, dass D-Gal eine Schädigung der Tight Junctions in der Hodenstützzelllinie TM4 der Maus induzieren kann. Daher wurden in diesem Experiment D-Galaktose (D-Gal) - induzierte 15P-1-Zellen als Schadensmodell verwendet, um die schützende Wirkung und den Mechanismus von ICA auf Sertoli-Zellschäden durch den Nrf2-Signalweg zu untersuchen.

In den letzten Jahren wurde Unfruchtbarkeit von der WHO als ein Problem der öffentlichen Gesundheit anerkannt. Die Inzidenzrate der Unfruchtbarkeit in der Allgemeinbevölkerung hat von Jahr zu Jahr zugenommen und betrifft etwa 15% der Paare im gebärfähigen Alter in der Welt. Untersuchungen zeigen, dass in den Vereinigten Staaten und anderen westlichen Ländern die Spermienzahl jährlich um 1,5% abnimmt, und es wird geschätzt, dass weltweit fast 70 Millionen Paare Opfer von Unfruchtbarkeit oder Sterilität geworden sind. Eine groß angelegte epidemiologische Untersuchung der WHO ergab, dass etwa die Hälfte der Unfruchtbarkeit von Paaren durch männliche Faktoren verursacht wird, wobei der Mechanismus noch nicht vollständig geklärt ist.

Forschungen haben ergeben, dass D-Gal die Anzahl und Funktion der Stützzellen der Mauslinie TM4 verringern kann. Daher haben wir das D-Gal-Modell gewählt, um zu untersuchen, ob ICA die Schädigung von 15P-1-Zellen lindern kann. In der Literatur wird berichtet, dass nach der Behandlung von Endothelzellen ECV-304 mit 35, 70 und 140 μ M ICA die Zellhemmungsrate 1,2% betrug und keine signifikante Zytotoxizität auftrat. Die MTT-Ergebnisse dieses Experiments zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe, wenn ICA allein zur Behandlung von 15P-1-Zellen verwendet wurde, die IC50 bei einer Konzentration von 40 μ M größer als 50% war, was darauf hindeutet, dass ICA keine signifikante Zytotoxizität hatte. Unsere vorläufige Forschung ergab, dass ICA eine schützende Wirkung auf TM4-Zellschäden hat, die mit D-Gal behandelt wurden, und eine signifikante proliferative Wirkung bei Konzentrationen von 0,5 und 1 μ M hat. Die MTT-Ergebnisse dieses Experiments zeigten auch, dass ICA im Vergleich zur D-Gal-Behandlungsgruppe die Zellüberlebensrate in einer konzentrationsabhängigen Weise bei 0,125-1 μ M erhöhte und eine signifikante fördernde Wirkung auf die Zellproliferation bei Konzentrationen von 0.5 und 1 μ M. Die fördernde Wirkung von ICA wurde abgeschwächt, wenn die Konzentration größer als 1 μ M war, was auf die längere Stimulationszeit von D-Gal auf 15P-1-Zellen in diesem Experiment, eine schwerere Zellschädigung und eine stark erhöhte Empfindlichkeit der geschädigten Zellen gegenüber der Medikamentenstimulation zurückzuführen sein könnte, wodurch ein Phänomen der Förderung bei niedriger Konzentration und der Hemmung bei hoher Konzentration auftritt. Hoden-Sertoli-Zellen sind somatische Zellen, die sich in den Hodenkanälchen befinden und direkt mit den spermatogenen Zellen verbunden sind. Sie regulieren die Proliferation und Differenzierung der spermatogonialen Stammzellen und fördern die Spermienbildung durch die Sekretion verschiedener Zytokine wie GDNF, BMP4 und SCF. GDNF gehört zur Superfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren beta und ist ein wichtiger Faktor bei der Regulierung der Proliferation von Spermatogonien-Stammzellen. Er spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der männlichen Geschlechtszellen und der frühen Hodenentwicklung. BMP4 und SCF sind wichtige Faktoren, die die Differenzierung von Spermatogonien-Stammzellen fördern. Frühere Untersuchungen unserer Forschungsgruppe haben gezeigt, dass die Gesamtflavonoide von Epimedium die mRNA- und Proteinkonzentrationen von GDNF, BMP4 und SCF, die von den Sertoli-Zellen in natürlich alternden Rattenhoden sezerniert werden, hochregulieren und die Sekretionsfunktion der Sertoli-Zellen verbessern können. Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus der von Sertoli-Zellen sezernierten Faktoren nach der D-Gal-Behandlung signifikant abnahmen, während die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus der von Sertoli-Zellen sezernierten Faktoren in 15P-1 nach der ICA-Behandlung signifikant hochreguliert wurden. ICA kann die Sekretionsfunktion von 15P-1 Hoden-Sertoli-Zellen verbessern.

Die Tight Junctions zwischen den Stützzellen sind die wichtigste Komponente der Blut-Hoden-Schranke, zu der vor allem die drei Transmembran-Proteinfamilien Occludin, Claudin und Adhäsionsproteine sowie die zytoplasmatische Proteinfamilie der Blocking Junction gehören. Die engen Verbindungen zwischen den Zellen schützen nicht nur die Fortpflanzungszellen vor dem Eindringen des Immunsystems und sorgen für ein gutes physiologisches Umfeld für die Spermatogenese, sondern ermöglichen es auch den prä- und postfeinen Spermatozyten, die Blut-Hoden-Schranke regelmäßig zur weiteren Entwicklung zu passieren. Forschungen haben ergeben, dass Occludin und Claudin die am frühesten identifizierten Tight Junction-Membranproteine sind und dass die Fähigkeit zur Bildung der Tight Junction und die epitheliale Barrierefunktion hauptsächlich durch Claudin vermittelt werden. Eine andere Studie hat gezeigt, dass die Injektion von synthetischem Occludin-Peptid in Rattenhoden die meisten Spermatogonien nach 27 Tagen reversibel abtöten kann, während das Ausschalten von Occludin in vitro auch zu einer Abnahme der Tight-Junction-Funktion der Stützzellen führen kann. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Expression des Tight Junction-Proteins in 15P-1-Zellen nach einer D-Gal-Behandlung abnahm, während die Expression des Tight Junction-Proteins in 15P-1-Stützzellen nach einer ICA-Behandlung signifikant erhöht war. ICA hat eine schützende Wirkung auf die Schädigung des Tight Junction-Proteins in 15P-1-Trägerzellen.

Wenn sich der Körper in einem normalen Zustand befindet, rekrutiert das Kelch-ähnliche ECH-assoziierte Protein-1 (Keap1) Nrf2 und bildet einen Komplex im Zytoplasma, der durch Ubiquitin-Protease abgebaut wird. Wenn oxidativer Stress auftritt, dissoziiert Nrf2 von Keap1, und Nrf2 wird vom Zytoplasma in den Zellkern verlagert, um an ARE zu binden und die Transkription nachgeschalteter Schutzgene wie HO-1 und NQO1 zu aktivieren, um dadurch oxidativen Stressschäden zu widerstehen, die durch verschiedene Stimuli im Körper verursacht werden. Unsere frühere Forschung hat gezeigt, dass ICA die Hoden-DNA-Schäden bei natürlich alternden Ratten lindern und den altersbedingten Rückgang der Fortpflanzungsfunktion durch die Aktivierung des Nrf2/HO-1-Signalwegs verbessern kann. Dies legt nahe, dass die Verbesserung der spermatogenen Dysfunktion durch ICA mit dem Nrf2-Signalweg zusammenhängen könnte. Frühere Studien haben gezeigt, dass ICA die D-Gal-induzierte Schädigung der Hodenstützzellen der TM4-Zelllinie verbessern kann. Daher wurden in dieser Studie mittels Western Blot die Proteine des Nrf2-Signalwegs nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Expressionsniveaus der wichtigen Nrf2-Wegproteine Nrf2, HO-1 und NQO-1 in 15P-1-Zellen nach D-Gal-Stimulation signifikant herunterreguliert wurden, während sie nach ICA-Verabreichung signifikant erhöht wurden. Anschließend wiesen wir die Expression und Lokalisierung von Nrf2 mittels Immunfluoreszenztechnik nach. Im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe war die Fluoreszenzexpression von Nrf2 im Kern von 15P-1-Zellen in der D-Gal-Behandlungsgruppe geschwächt, verbesserte sich aber nach der ICA-Behandlung. Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass die funktionellen und strukturellen Schäden der 15P-1-Zellen mit der Herunterregulierung des Nrf2-Signalwegs zusammenhängen, was zu einer Abnahme der zellulären antioxidativen Kapazität führt. ICA könnte die Schädigung der 15P-1-Zellen durch eine Erhöhung ihrer antioxidativen Kapazität verbessern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ICA die Expression der mit der Sekretion verbundenen Proteine GDNF, BMP4 und SCF sowie der mit der tight junction verbundenen Proteine Occludin und Claudin-1 in 15P-1-Zellen durch die Aktivierung des Nrf2-Signalwegs hochregulieren und dadurch die D-Gal-induzierten Schäden in 15P-1-Zellen verbessern kann. Dieses Experiment hat eine theoretische Grundlage für unsere nachfolgende Forschung über die schützende Wirkung und den Mechanismus von ICA auf Keimzellen gelegt, um den Anwendungswert der chinesischen Kräutermedizin Epimedium im Fortpflanzungssystem besser zu erforschen und neue Wege für die klinische Behandlung der männlichen Unfruchtbarkeit aufzuzeigen.