Fordeling af endofytiske bakterier og foreløbig screening af steroidale saponinproducerende stammer i Xiangmaidong på forskellige vækststadier
Xiangmaidong, også kendt som Hubei maidong Liriope spicata var. prolifera Y.T. Ma, er en af kildeplanterne til Shanmaidong i Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2010-udgaven). Steroide saponiner er dens vigtigste aktive ingrediens, og dens sapogenin-basisskelet tilhører derivatet af spirostan (bestående af 27 kulstofatomer). I henhold til C25-konfigurationen i spirostanstrukturen og F-ringens cykliske tilstand kan den opdeles i følgende fire hovedtyper: spirostanol (C25 er S-konfiguration), isosterostanol (C25 er R-konfiguration) og furostanol (F-ringen er et åbent kædederivat).), modificerede spirostanolalkoholer (F-ringen er en femleddet tetrahydrofuranring). Fjorten typer steroide saponiner er blevet isoleret fra Ophiopogon japonicus, hvor de vigtigste glykosider er diosgenin og ruscogenin, som begge er C25 (S)-isomerer. Blandt dem er indholdet af saponiner C (Ls-S3) i Ophiopogon japonicus relativt højt. Steroide saponiner har flere farmakologiske aktiviteter, og bortset fra nogle få, der kan syntetiseres kemisk, udvindes de hovedsageligt direkte fra traditionelle kinesiske lægemidler gennem kemisk ekstraktion. Xiangmaidongs steroide saponiner er ingen undtagelse. Men på grund af problemer som lange produktionscyklusser, kontinuerlige dyrkningshindringer i marken, lavt saponinindhold, høje udvindingsomkostninger og betydelig miljøforurening er den bæredygtige produktion og forsyning af Xiangmaidong steroide saponiner begrænset. Derfor er det nødvendigt at finde nye måder at fremstille saponiner på i store mængder.

Der har tidligere været undersøgelser, som rapporterede om isolering af endofytiske bakterier, der kunne producere steroide saponiner fra Dianzhong- og Huazhong-bygninger. Inspireret af dette forsøgte vores forskerteam at isolere og opdage endofytiske bakteriestammer, der metaboliserer og producerer steroide saponiner fra Xiangmaidong. Ved hjælp af renkulturmetoder og 16SrDNA-PCRDGGE-teknologi analyserede og identificerede vi fordelingen af endofytiske bakterier i prøver (knolde eller rødder) af Xiangmaidong i løbet af dens første fremkomst, hurtige ekspansion og modne høstperioder. Samtidig blev farvereaktion, TLC og HPLC-metoder brugt til foreløbigt at evaluere saponinproduktionsevnen hos de opnåede rene kulturstammer for at opnå målstammerne og give teoretisk støtte til "fabriks-, skala- og hurtig" produktion af steroide saponiner.

Ved hjælp af traditionelle mikrobielle renkulturmetoder isolerede denne undersøgelse 15 slægter og 22 arter af endofytiske bakterier fra rodknolde og fibrøse rødder af Xiangmaidong i forskellige vækststadier. Blandt dem var der 4 arter af Bacillus og 4 arter af Staphylococcus, 2 arter af Pseudomonas og de resterende 12 slægter, herunder Salmonella, Enterobacter, Pseudoxanthomonas, Morganella, Agrobacterium, Microbacterium, Porphyromobacter, Acinetobacter, Lysinibacter og Sphingosine. Der findes kun én bakterieart i slægterne Sphingomonas, Sphingomonas og Curtobacterium.

Gennem 16SrDNA PCR DGGE-identifikation fandt denne undersøgelse, at den endofytiske bakteriesamfundsstruktur i Xiangmaidong stort set var den samme i den indledende periode, den hurtige ekspansionsperiode og den modne høstperiode for dens knolde, med lille forskel i stammegrupper. Gennem sekvenstilpasning blev 15 slægter og 21 bakteriearter identificeret fra de isolerede sekvenser, herunder 3 arter af Bacillus og 3 arter af Staphylococcus, 2 arter af Serratia og 2 arter af Pseudomonas, og de resterende 11 slægter, herunder Pseudomonas, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Porphyromobacter, Curtobacterium, Enterobacter, Methylobacterium, nitrogenfiksering. Der er kun én stamme af Azotobacter, Microbacterium og Pseudoclavibacter. Sammenlignet med de 22 stammer af rene endofytiske bakterier, der er nævnt ovenfor, har DGGE identificeret 7 nye slægter: Serratia, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Methylobacterium, Azotobacter og Pseudomonas.

Denne undersøgelse evaluerede saponinproduktionsevnen hos rene dyrkbare endofytiske stammer og identificerede foreløbigt tre bakteriestammer, Pseudoxanthomonas mexicana, Staphylococcus caprae og Microbacterium testaceum, med betydelige egenskaber ved at producere steroide saponiner. Ifølge HPLC-detektionsresultaterne viste disse tre endofytiske bakterier alle karakteristiske toppe på tidspunkterne 15,98, 57,64 og 75,19 minutter, hvilket indikerer, at mindst tre saponiner i deres fermenteringsprodukter kan have den samme struktur, hvilket kræver yderligere eksperimentel verifikation. På nuværende tidspunkt er der to hovedstrategier til påvisning af steroide saponiner: den ene er direkte påvisning, og den anden er indirekte påvisning gennem kvalitativ og kvantitativ analyse af spaltede saponiner. Forskere har brugt HPLC-metoden til at bestemme indholdet af dioscin i Dioscorea nipponica, arrowroot, sisal og liljeknopper. På grund af manglen på standardiserede og isolerede rene prøver af steroide saponiner fra Xiangmaidong i dette eksperiment blev de forberedte steroide saponiner fra Xiangmaidong-rod (blanding) midlertidigt brugt som positive kontroller. Ved at sammenligne, om karakteristiske toppe på samme tidspunkt kunne vises under de samme detektionsbetingelser, blev glykosidproduktionsegenskaberne for endofytiske bakterier foreløbigt identificeret. I fremtiden vil vores laboratorium yderligere adskille og rense fermenteringsproduktets saponinekstrakt og bruge massespektrometri, kernemagnetisk resonans og andre metoder til mere præcis karakterisering.

Baseret på DGGE-analysen af den høje variable region af 16SrDNA V6 ～ V8 og kombineret med screeningsresultaterne af rene dyrkede endofytiske bakterier, der er i stand til at producere steroide saponiner, fandt dette eksperiment et fænomen: i den hurtige ekspansionsperiode og modne høstperiode af Xiangmaidongs rodknolde kan mexicansk pseudogul pseudomonas P. påvises fra dens rodknolde Tilstedeværelsen af mexicana blev ikke påvist i den indledende fase af rodknolde. Det er blevet bekræftet, at biomassen og indholdet af steroide saponiner i rodknoldene fra Xiangmaidong gradvist øges fra den indledende fase og når deres højdepunkt under den hurtige ekspansion og modenhedsfasen af høsten. Betyder dette fænomen, at Pseudomonas aeruginosa i Mexico spiller en positivt korreleret rolle i ophobningen af steroide saponiner i knoldene fra Ophiopogon japonicus? Dette kræver også yderligere eksperimentel verifikation.