Undersøgelse af antitumoraktiviteten af phenylspirodrianforbindelser i Stachybotrys sp. CPCC401591, en svamp, der tilhører slægten vindrueskimmel
Stachybotrys, en svamp, der tilhører familien Stachybotryaceae, er en saprofytisk eller svagt parasitisk art, der er almindeligt forekommende i jord, planter og fugtige indendørsmiljøer. De sekundære metabolitter, der produceres af denne svampeslægt, har et rigt udvalg af strukturelle typer, herunder trichothecener, diterpener, phenylspiradrianes (PSM), polyketoner, anthraquinoner, cykliske peptider og alachalasiner. Disse forbindelser har betydelige biologiske aktiviteter inden for antitumor, antibakteriel, antimalaria, antiviral, kolesterolesterasehæmning og antiinflammatoriske aspekter. I de senere år er der løbende blevet isoleret og rapporteret om nye aktive stofmolekyler fra Botrytis-slægten. Li et al. isolerede og identificerede monotrichothecener fra S. chartarum WGC-25C-6 isoleret fra svampe. Blandt dem udviser forbindelser som mytoxin A og satrotoxin G betydelig antitumoraktivitet mod HCT-116, HepG2, BGC-823 og andre cellelinjer med IC50<0,01 μ mol/L. Yang et al. identificerede seks diterpenoidforbindelser fra den marine afledte papirdruesvamp J403-SS6. Atranone Q viste signifikante hæmmende virkninger på patogene bakterier, herunder Candida albicans og Enterococcus faecalis, med MIC-værdier på henholdsvis 8 og 16 μ g/mL.

PSM-forbindelsesfamilien er enorm, og siden 1980 har Miyazaki et al. studeret vindrueskimmel S K-76, en komplementinhibitor, blev isoleret fra complementi, og næsten 120 PSM-klasse forbindelsesmolekyler er blevet identificeret og isoleret. Ma et al. fra S Elleve monomere forbindelser i PSM-klassen blev isoleret fra chartarum MXH-X73. Undersøgelser har vist, at stacky botrin D kan hæmme vildtype-HIV-1 og ikke-nukleosid revers transkriptasehæmmere (NNRTI'er) tolerant HIV (såsom HIV-1 RT-K103N) med EC50-værdier fra 6,2 til 23,8 μ mol/L. Liu et al. fra S Elleve dimermolekyler i PSM-klassen (bistachibotyrosiner L~V) blev isoleret fra Chartarum CGMCC 3.5365. Blandt dem udviste forbindelsen bistachibotyrosin L signifikant antitumoraktivitet mod HepG2, HCT-116, NCI-H460 og andre cellelinjer med IC50-værdier fra 1,8 til 3,5 μ mol/L.
Denne undersøgelse valgte den endofytiske svamp Stachybotrys sp. CPCC 401591 til dybdegående forskning. Ved at kombinere OSMAC-teknologi, LC-MS/MS-molekylær netværksanalyse og PSM-forbindelsens UV-absorptionsegenskaber blev ethylacetatfaseseparation og oprensning af faste risfermenteringsprodukter fra stamme CPCC 401591 undersøgt. Samtidig sigter vi mod at udtrække og isolere antitumoraktive molekyler fra denne stamme kombineret med tumorcellescreeningsmodeller såsom den humane levercancercellelinje HepG2. Forskning har vist, at drueøresvampen CPCC 401591 kan producere PSM-forbindelser og er en ressourcebakterie, der er værd at undersøge nærmere.

Denne undersøgelse anvendte OSMAC-teknologi og LC-MS/MS-molekylær netværksanalysestrategi kombineret med forskellige kromatografiske og moderne spektroskopiske metoder til at isolere 8 PSM-forbindelser fra drueøresvampen Stachybotrys sp. CPCC 401591. I de senere år har minedrift og analyse af genomiske data fra trådformede svampe vist, at de fleste svampe typisk indeholder 40-60 biosyntetiske genklynger (BGC'er) relateret til biosyntese af naturlige produkter. De aktuelt isolerede og identificerede metabolitter er dog stadig "toppen af isbjerget". De fleste BGC'er i filamentøse svampes genom er tavse eller skjulte, og det mulige kodede "mørke stof" er endnu ikke blevet identificeret. OS-MAC-teknologien er ikke rettet mod aktivering af specifikke tavse genklynger, men snarere mod systematisk ændring af let anvendelige dyrkningsparametre (herunder mediets sammensætning, pH-værdi og dyrkningstemperatur) for at opnå strukturelt nye bioaktive molekyler. Det gør OSMAC-teknologien til en billig, effektiv, alsidig og relativt enkel forskningsmetode til aktivering af mikrobiel sekundær metabolisme. Denne undersøgelse fokuserer på stammen CPCC 401591 og bruger OSMAC-strategien til at undersøge virkningerne af PDB-, BY-, F2- og risfermenteringsmedier på svampens sekundære metabolitter. Baseret på mængden og udbyttet af sekundære metabolitter i stammen blev ris-kulturmediet bestemt til at være det optimale fermenteringsmedium, hvilket indikerer, at OSMAC-teknologien forbedrer effektiviteten af udvinding af sekundære metabolitter i denne stamme betydeligt. Samtidig anvendte denne undersøgelse GNPS-molekylær netværksanalysestrategi til at analysere ethylacetatfasen af fermenteringsekstraktet af stamme CPCC 401591. Analytens sekundære massespektrometri-data blev sammenlignet med de sammensatte massespektrometri-data i databasen for hurtigt at identificere de sammensatte kategorier, der er indeholdt i analytprøven, og yderligere hjælpe med den effektive opdagelse af bioaktive molekyler.

PSM-forbindelser er i øjeblikket kun isoleret fra svampe af slægterne Botrytis og Umeda, hvilket gør dem til karakteristiske molekyler for disse to typer svampe. Forbindelsen stackybotrin D udviser betydelig anti-HIV-aktivitet med EC50-værdier fra 6,2 til 23,8 μM mod HIV-1 wt, HIV-1 RT-K103N og andre mutantstammer. Jia et al. fandt, at IC50-værdierne for bistachybotrysin K på tumorcellelinjer som HCT116 og NCI-H460 varierede fra 1,1 til 4,7 μ M. Dette studie undersøgte de sekundære metabolitter i stammen Stachybotrys sp. CPCC 401591. Ved at kombinere forbindelsernes karakteristiske UV-absorption (230, 285, 330 nm) og anvende forskellige kromatografiske og moderne spektroskopiske teknikker blev strukturerne af otte PSM-forbindelser isoleret og bestemt. Yderligere kombineret med GNPS-analyse viste det sig, at fermenteringsekstraktet af stammen stadig indeholdt flere monomerer og PSM-klasse dimerforbindelsesmolekyler, men monomerforbindelserne kunne ikke opnås på grund af det lave indhold. Derfor kan der findes flere PSM-molekyler ved yderligere at øge fermenteringsudbyttet, optimere fermenteringsbetingelserne og kombinere HPLC-UV-MS-teknologi. På nuværende tidspunkt har vi afsluttet helgenomsekventeringen af stammen Stachybotrys sp. CPCC 401591 og lokaliseret to mulige biosyntetiske genklynger psd1 og psd2 af PSM-forbindelser ved hjælp af genome mining-metoder. Begge genklynger indeholder gener, der koder for polyketidsyntase og sesquiterpensyntase, mens denne genklynge koder for rigelige postmodificerende enzymer (herunder oxidase P450s, kortkædet dehydrogenase og acetyltransferase osv.) Dette danner grundlag for vores fremtidige forskning i brugen af gen-knockout-strategier til at belyse biosyntesevejene for PSM-forbindelser og identificere de vigtigste biologiske enzymers funktioner. Derfor indikerer denne undersøgelse, at drueøresvampen Stachybotrys sp. CPCC 401591 kan producere PSM-forbindelser, hvilket beriger den strukturelle mangfoldighed af dens sekundære metabolitter. Det er en vigtig ressourcebakterie, der fortjener yderligere forskning.