Effekten af Shengcao phenol, der regulerer Akt/mTOR-vejen på autofagi i gliomceller. Glioblastom multimodal (GBM) er den mest almindelige maligne tumor i centralnervesystemet med høj malignitet og invasivitet. Selv efter omfattende behandling med kirurgi, strålebehandling og kemoterapi er der stadig risiko for tilbagefald og metastaser. Temozolomid (TMZ) er et førstevalgspræparat mod gliom i klinisk praksis. Men på grund af dets alvorlige bivirkninger som f.eks. blodtoksicitet begrænser det i høj grad den kliniske brug af TMZ og påvirker i alvorlig grad dets effektivitet. Derfor er det af stor betydning at finde nye effektive lægemidler mod gliom med lav toksicitet.
Autofagi, som er en programmeret celledødsmekanisme, er et dynamisk nedbrydnings- og kredsløbssystem. Autofagi er en dynamisk proces, der involverer tre tilstande: fagoforer, autofagosomer og autolysosomer. I de senere år har forskning vist, at abnormiteter i cellulær autofagi er tæt forbundet med forekomsten og udviklingen af tumorer. I gliomer kan unormal regulering af autofagi fremme tumorvækst, mens indgreb i autofagi kan føre til gliomcelledød og dermed hæmme tumorprogression. Derfor er det en meget lovende forskningsretning at udforske nye metoder til behandling af gliomer, der er rettet mod autofagi.
Den kemiske struktur af eriodictyol (ERD) er vist i figur 1. Det er et naturligt spiseligt flavonoid, som findes i grøntsager og frugter, især i citrusfrugter, hvor det er mest udbredt. Forskning har vist, at resveratrol har flere farmakologiske virkninger, herunder antioxidant-, antiinflammatorisk- og antitumoreffekt. Vores tidligere forskning viste, at resveratrol kan fremkalde apoptose og hæmme metastase af gliomceller, men dets effekt på autofagi er endnu ikke blevet undersøgt. Formålet med denne undersøgelse er at udforske resveratrols virkning på spredning og autofagi af gliomceller gennem eksperimenter og yderligere undersøge de mulige molekylære mekanismer, hvilket giver et grundlag for at belyse den farmakologiske mekanisme af resveratrol mod gliom.

 

Gliomer er tumorer i centralnervesystemet med den højeste forekomst og dødelighed, kendetegnet ved stærk invasivitet, hurtig malign progression og ekstremt lave helbredelsesrater med en median overlevelsesperiode på mindre end et år. På grund af de biologiske egenskaber ved meget invasiv vækst i GBM er det næsten umuligt at garantere fuldstændig tumorresektion under operationen, og den postoperative tilbagefaldshastighed er ekstremt høj. Derfor anvendes der i klinisk praksis normalt en omfattende behandlingstilgang med kirurgi + strålebehandling og kemoterapi.

På nuværende tidspunkt findes der ikke noget ideelt lægemiddel til behandling af gliom. De almindeligt anvendte lægemidler i klinisk praksis omfatter hovedsageligt biologiske alkyleringsmidler, målrettede antitumorlægemidler og immuncheckpoint-hæmmere. TMZ er et førsteklasses kemoterapeutisk lægemiddel til behandling af GBM, men dets selektivitet er dårlig, det er tilbøjeligt til lægemiddelresistens, og det har stærke bivirkninger, hvilket ofte resulterer i utilfredsstillende behandlingsresultater. Målrettede antitumorlægemidler og immuntjekpunkthæmmere har karakter af høj selektivitet og minimale bivirkninger og er gradvist blevet almindelige antitumorlægemidler i udlandet. Målrettede lægemidler og immuncheckpoint-hæmmere er dog dyre, og langvarig brug udgør en tung økonomisk byrde og et stort pres på patienterne. Derfor er søgningen efter nye effektive lægemidler mod gliom med lav toksicitet og til en overkommelig pris i øjeblikket et varmt emne inden for gliomforskning. Traditionel kinesisk medicin og naturlige aktive produkter i vores land har rigelige kilder, mange typer, relativt små toksiske bivirkninger og har karakter af brede dimensioner, multi-level og multi-target omfattende effekter, som har unikke fordele i antitumorbehandling. Så udforskning af effektive anti-gliom-ingredienser fra naturlige aktive produkter og traditionel kinesisk medicin kan være en effektiv måde at løse det nuværende dilemma på.

ERD, som er et naturligt flavonoid, har tiltrukket sig opmærksomhed og forskning på grund af sin brede vifte af biologiske aktiviteter. Tidligere fokuserede forskningen i ERD hovedsageligt på antiinflammatoriske og antioxidante effekter, men vores seneste undersøgelse viste, at resveratrol kan hæmme gliomcellers metastase betydeligt og fremkalde deres apoptose. Desuden viste Tang et al.s undersøgelse, at i nasopharyngeal carcinoma CNE1-celler hæmmede ERD signifikant celleproliferation gennem autofagiformidling. Wang et al. fandt, at ERD spiller en beskyttende rolle ved cerebral iskæmi-reperfusionsskade hos rotter ved at regulere autofagi. Ovenstående forskningsresultater tyder på, at ERD har en regulerende effekt på cellulær autofagi og kan udøve anticancereffekter ved at påvirke autofagi.

Dette studie undersøgte effekten af ERD på autofagi i gliomer. For det første bekræftede vi gennem CCK-8-reagens og klondannelseseksperimenter, at ERD har en god hæmmende effekt på gliomceller, hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere forskningsresultater. For at undersøge, om ERD har en effekt på autofagi i gliomer, målte vi ekspressionsniveauerne af autofagi-relaterede proteiner LC3, Beclin 1 og ATG5 og observerede antallet af autofagosomer ved hjælp af fluorescens. Resultaterne viste, at udtrykket af LC3B, Beclin 1 og ATG5 var signifikant opreguleret i gliomceller, der blev behandlet med ERD, og antallet af autofagosomer var også signifikant øget. ERD inducerer autofagi i gliomceller. Autofagi er en dynamisk proces, der omfatter tre tilstande: autofagosomer, autofagosomer og autolysosomer. Når celler gennemgår autofagi, dannes der først autofagosomer, som derefter smelter sammen med lysosomer for at danne autolysosomer og efterfølgende nedbryder proteiner og andre stoffer, der er indkapslet i dem. Vi transfekterede cellelinjen med GFP-mRFP-LC3B dobbelt fluorescerende plasmid for at konstruere stabile celler, der udtrykker rødgrønt fluorescerende protein. Vi observerede autofagi-flowet ved at udnytte karakteristikken af GFP-fluorescerende proteins reducerede fluorescensintensitet under lave pH-forhold. Når autofagosomer smelter sammen med lysosomer for at danne autolysosomer, falder pH-værdien inde i vesiklerne, og efter kombinationen af rød og grøn fluorescens viser cellerne en rødlig fluorescens. Ellers har de en tendens til at blive gule. Resultaterne viste, at gliomceller efter ERD-behandling udviste lysegul fluorescens og øget ekspression af P62-protein, som er et substrat for autofagosomer. Men når ERD blev behandlet sammen med autofagi-induceren RAP, blev effekten af ERD delvist vendt. Ovenstående eksperimentelle resultater tyder på, at ERD fremmer dannelsen af autofagosomer i gliomceller, men hæmmer det autofagiske flow.

Akt/mTOR-signalvejen spiller en afgørende regulerende rolle i cellulær autofagi og er et potentielt mål for tumorbehandling. For yderligere at undersøge den potentielle mekanisme for ERD, der påvirker autofagi i gliomceller, undersøgte vi derfor effekten af ERD på udtrykket af Akt/mTOR-relaterede proteiner. Resultaterne viste, at ERD kunne hæmme udtrykket af p-Ak og p-mTOR, og denne effekt blev delvist vendt af Akt-agonisten 740 Y-P. Dette tyder på, at ERD kan påvirke gliomcellernes autofagi ved at nedregulere Akt/mTOR-vejen. Endelig observerede vi effekten af ERD på glioma-autofagi in vivo ved hjælp af en subkutan tumormodel med nøgen mus, og de eksperimentelle resultater var i overensstemmelse med dem in vitro og in vivo.

Sammenfattende undersøgte denne undersøgelse foreløbigt effekten af ERD på autofagi i gliomceller. Det blev fundet, at ERD delvist kan hæmme Akt/mTOR-vejen, regulere udtrykket af autofagi-relaterede proteiner ATG5, Beclin1, LC3 og P62, påvirke autofagi-processen i gliomceller og derved hæmme gliomcelleproliferation og i sidste ende udøve anti-gliom-effekter. Den molekylære mekanisme, hvormed ERD regulerer det autofagiske flow, er dog ikke blevet fuldt ud belyst i denne undersøgelse, hvilket kræver yderligere undersøgelser.