Analyse af dehydroabietinsyres potentiale som hæmmer af PI3K/AKT/mTOR-signalvejen baseret på computersimuleringsteknologi
PI3K/AKT/mTOR-signalvejen spiller en vigtig rolle i processerne for celleproliferation, differentiering og apoptose og er overaktiveret i mange tumorceller. Det har vist sig at fremme udviklingen af lægemiddelresistens i tumorceller. Hæmning af aktiveringen af denne signalvej kan fremme tumorcelleapoptose og genoprette tumorcellers følsomhed over for lægemidler. Derfor er udviklingen af småmolekylære PI3K/AKT/mTOR-signalvejshæmmere blevet et af forskningens hotspots for anti-tumormedicin. Dehydroabietic acid (DHA) er en vigtig tricyklisk diterpenoid naturlig harpikssyre og en af komponenterne i traditionel kinesisk medicin kolofonium. Det opnås hovedsageligt ved at adskille kolofonium gennem disproportioneringsreaktion. Det har stabile egenskaber og en struktur, der ligner steroidmolekyler, og er blevet brugt i vid udstrækning til syntese og udvikling af fluorescerende reagenser og lægemiddelmellemprodukter. Dehydroabietinsyre og mange af dens derivater udviser fremragende antitumoraktivitet. Nylige rapporter har vist, at 1H-benzo[d]imidazolderivater af dehydroabietinsyre har hæmmende virkninger på PI3K α og kan nedregulere ekspressionen af fosforyleret AKT. Vores forskning viste også, at nogle B-ringmodificerede dehydroabietinsyrederivater kan reducere ekspressionsniveauerne af fosforyleret PI3K, AKT og mTOR samt fosforyleringsniveauerne af deres downstream-effektorer S6 og 4EBP1. Selvom forskellige derivater af dehydroabietinsyre har vist visse hæmmende effekter på PI3K/AKT/mTOR-signalvejsproteinerne, er det i øjeblikket uklart, om dehydroabietinsyre i sig selv har den tilsvarende hæmmende evne, og der er behov for yderligere forskning.

De fleste forbindelser udøver deres virkning ved at binde sig til proteinmolekyler, og deres bindingsmåder og -evner kan verificeres ved hjælp af metoder som proteinkrystalanalyse og fluorescensdæmpning af proteiner. Men forsøgsperioden er lang, og omkostningerne er høje. Molekylær docking-teknologi er et middel til at bruge computere til at udføre teoretiske beregninger og forudsige bindingen mellem forbindelser og receptorproteiner. Baseret på docking-bindingsenergien kan bindingsevnen mellem forbindelser og proteiner bestemmes, og potentielle proteinmodulatorer kan screenes; Foreløbig mekanismeforskning kan også udføres gennem den opnåede docking-konfiguration og andre docking-scores. Derudover kan forståelse af lægemiddelegenskaber og farmakokinetiske egenskaber ved forbindelser som absorption, distribution, metabolisme, udskillelse og toksicitet i menneskekroppen afgøre, om de kan bruges som kandidatforbindelser til klinisk behandling. For at reducere forskningsomkostningerne er computerstøttede programmer gradvist blevet brugt til indledende undersøgelser af lægemidlers lighed og farmakokinetik.

Derfor brugte denne undersøgelse molekylær docking-teknologi til at forudsige dehydroabietinsyrens bindingsevne og bindingsmåde til nøgleproteiner i denne vej og verificerede den faktiske hæmning af dehydroabietinsyre ved hjælp af proteinimmunoblotting. Desuden blev en netværksserver brugt til at simulere lægemiddellignende egenskaber og farmakokinetik for foreløbigt at forstå potentialet i dehydroabietic acid som en hæmmer af PI3K/AKT/mTOR-signalvejen og give et teoretisk grundlag for yderligere udvikling af dehydroabietic acid.

PI3K/AKT/mTOR-signalvejen spiller en vigtig rolle i processerne for celleproliferation, differentiering og apoptose og er også et af målene for kræftbehandling. PI3K består hovedsageligt af den katalytiske underenhed p110 og den regulatoriske underenhed p85. Efter aktivering af fosforylering kan den omdanne sit substrat 3,4-fosfatidylinositol (PIP2) til 3,4,5-trifosfatfosfatidylinositol (PIP3). PIP3 kan binde sig til AKT og fremme AKT-phosphorylering gennem phosphoinositolafhængig proteinkinase 1 (PDK1). AKT aktiveret af fosforylering kan direkte eller indirekte fosforylere mTOR og derved yderligere fremme fosforyleringen af downstream-effektorproteiner 4EBP1 og S6 for at regulere intracellulær biokemisk aktivitet.

Denne undersøgelse er baseret på den kontinuerlige udvikling af anticancerderivater af dehydroabietic acid i de senere år, hvoraf nogle er rapporteret at have hæmmende virkninger på nøgleproteiner i PI3K/AKT/mTOR-signalvejen. For at undersøge effekten af dehydroabietic acid som råmateriale på PI3K/AKT/mTOR-signalvejen og give et grundlag for udvikling af dehydroabietic acid anticancer-derivater. Dehydroabietinsyrens bindingsevne og bindingsmåde til ATP-bindingsstederne for nøgleproteinerne PI3K, AKT og mTOR i signalvejen blev forudsagt ved hjælp af molekylær docking-teknologi. Den hæmmende effekt af dehydroabietic acid på pathway blev undersøgt ved hjælp af proteinimmunoblotting, og potentialet for dehydroabietic acid som et oralt lægemiddel blev forudsagt gennem foreløbige lægemiddellignende og farmakokinetiske simuleringer.

De molekylære dockingresultater viste, at dehydroabietic acid har en vis bindingsevne til ATP-bindingssteder for forskellige nøgleproteiner, med den svageste binding til AKT3 ved en minimal bindingsenergi på -6,16 kcal/mol og den stærkeste binding til AKT1 ved en minimal bindingsenergi på -8,04 kcal/mol. Dehydroabietinsyrens bindingsevne til signalvejsproteiner er svagere end den oprindelige ligands som en meget effektiv inhibitor, hvilket svarer til det dehydroabietinsyrebaserede PI3K/AKT/mTOR-signalvejsinhibitormolekyle DBDA, som vi har syntetiseret. På ATP-bindingssteder er interaktionsresterne mellem dehydroabietic acid og proteiner for det meste hydrofobe rester. Bortset fra Lys890 i PI3K δ er andre nøglerester, der spiller den vigtigste rolle i ligandproteinbindingen, også hydrofobe rester. Det indikerer, at dehydroabietinsyre kan udøve hæmmende virkninger ved at binde sig til ATP-bindingsstedernes glandulære gyrus. Interaktionsresterne mellem forskellige proteiner og dehydroabietic acid overlapper betydeligt med dem fra den oprindelige ligand, hvilket indikerer, at dehydroabietic acid kan konkurrere med ATP på samme måde som den oprindelige ligand for at hæmme proteinets virkning. Desuden har strukturer uden hydrogenbindinger, såsom dehydroabietinsyre med PI3K α, AKT2 og AKT3, højere bindingsenergier end andre strukturer med hydrogenbindinger, hvilket indikerer, at hydrogenbindinger spiller en vigtig rolle i den stabile binding af dehydroabietinsyre til proteiner. I konfigurationen af dehydroabietinsyrebinding genereres alle hydrogenbindinger ved carboxylpositionen. Der er dog flere overlappende rester nær isopropyl- og benzenringene, der interagerer gennem hydrogenbindinger i den oprindelige ligand. Denne funktion antyder, at når man designer nye hæmmere af den dehydroabietiske syrebaserede PI3K/AKT/mTOR-signalvej, kan carboxylpositionens hydrofile evne forbedres, og hydrofile grupper kan indføres i isopropyl- og benzenringpositionerne, hvilket kan forbedre den nye forbindelses evne til at binde sig til proteiner.

Proteinimmunoblotting-eksperimenter viste, at efter behandling med dehydroabietinsyre blev udtrykket af PI3K-reguleret underenhed p85 i SCC9-celler reduceret betydeligt. Faldet i p85-indhold kan hindre dannelsen af PI3K og blive en af de faktorer, der reducerer fosforyleringsudtrykket af downstream-protein AKT i PI3K. Det samlede protein i AKT og mTOR viste ingen signifikante ændringer sammenlignet med den blanke gruppe under forskellige koncentrationer af dehydroabietic acid, men udtrykket af fosforylerede proteiner blev signifikant reduceret, hvilket indikerer, at fosforyleringsprocessen i AKT og mTOR blev hæmmet. Det nedsatte fosforyleringsudtryk af 4EBP1 nedstrøms for mTOR kan skyldes, at 4EBP1 også kan aktiveres gennem MEK/Erk-signalvejen. Downstream-fosforyleringsudtrykket af et andet effektorprotein S6K1, der reguleres af mTOR, blev markant reduceret, hvilket kan skyldes hæmning af mTOR-fosforylering, hvilket fører til et fald i S6K1-aktivering og dermed reducerer fosforyleringsreaktionen af S6. Samlet set blev udtrykket af PI3K/AKT/mTOR-signalvejen i SCC9-celler hæmmet af dehydroabietic acid, hvilket er i overensstemmelse med de forudsagte resultater i molekylær docking.

I forudsigelsen af lægemiddelegenskaber og farmakokinetik viser Lipinski-reglen om fem analyser af dehydroabietic acid, at dens molekylvægt, LogP, rotationsbinding, hydrogenbindingsacceptor og hydrogenbindingsdonorværdier alle ligger inden for det område, der kræves af denne empiriske regel. Farmakokinetisk forudsigelse simulerer absorption, distribution, metabolisme, udskillelse og toksicitet af dehydroabietic acid in vivo, og dehydroabietic acid har bestået de fleste af testene, hvilket indikerer, at det kan være i stand til at udøve lægemiddelvirkninger godt in vivo.

Sammenfattende viste denne undersøgelse, at dehydroabietinsyre i sig selv kan blive en terapeutisk kandidat til at hæmme PI3K/AKT/mTOR-signalvejen for at lindre tumorcelleresistens og antitumoreffekter gennem forudsigelse af molekylær docking, proteinimmunoblotting-eksperimenter, test af lægemiddellighed og farmakokinetisk forudsigelse. Der kan foretages yderligere ændringer af dehydroabietinsyrens struktur for at udvikle mere effektive hæmmere af den dehydroabietinsyrebaserede PI3K/AKT/mTOR-signalvej.