Forskning i højkapacitetsdetektionsmetode af Lingzhi Ergothionein
Ergothionein (EGT), også kendt som 2-thio-Lhistidin trimethyl indre salt, er en naturlig aminosyre, der findes i rigelige mængder i mange dyr og planter. Den syntetiseres kun i nogle mikroorganismer (actinomyceter, streptomyces), svampe og visse cyanobakterier og kan ikke syntetiseres af dyreorganismerne selv. Menneskekroppen kan kun indtage EGT fra fødevarer og akkumulere høje koncentrationer af EGT i forskellige celler og væv gennem den meget specifikke organiske kationtransportør novel type-1 (OCTN1). EGT betragtes som en stærk antioxidant, og Servillo et al. udforskede dens antioxidantmekanisme, idet de mente, at den har en unik redoxmekanisme, og foreslog en unik antioxidantvirkning af EGT i celler. Standardoxidationsreduktionspotentialet for EGT er -0,06V, mens potentialet for andre thioler generelt er mellem -0,32V og -0,2V. Derfor er EGT mere stabil end andre antioxidanter i fysiologiske pH-miljøer og er mindre tilbøjelig til spontan oxidation. Forskning har vist, at EGT har flere vigtige fysiologiske funktioner, såsom antiinflammatoriske virkninger; Cellebeskyttelsesfunktion opnået ved at beskytte DNA; Den antidepressive funktion opnået ved at fremme neuronal differentiering og neurogenese; Øjenbeskyttelsesfunktion opnået ved at modstå oxidativ stress; Kardiovaskulær og cerebrovaskulær beskyttelsesfunktion opnået ved at afbryde ekspressionen af adhæsionsmolekyler relateret til åreforkalkning; EGT har en bred vifte af anvendelsesmuligheder i industrier som medicin, mad og kosmetik på grund af dets forebyggende og terapeutiske virkninger på neurodegenerative sygdomme opnået ved at hæmme toksicitet og dets iboende sikkerhed.

Produktionsmetoderne for EGT omfatter kemisk syntese, ekstraktion af spiselige svampe og mikrobiel fermentering. På grund af de høje omkostninger og den komplekse proces med de to første er dyb fermentering af spiselige svampehyfer i øjeblikket den almindelige metode til industriel produktion af EGT. Naturlige stammer har dog lav EGT-produktion, og det er nødvendigt at dyrke industrielle EGT-stammer med højt udbytte gennem avlsteknikker. Metoderne til dyrkning af industrielle spiselige svampestammer omfatter mutageneseavl, hybridiseringsavl, genteknologisk avl og protoplastfusionsavl. Hver forædlingsmetode kræver dog flere store tests af EGT-indhold. Det skal bemærkes, at betydningen af test af EGT-indhold i avlsprocessen mere er at sammenligne indholdet mellem prøver. På nuværende tidspunkt omfatter detektionsmetoderne for EGT højtydende væskekromatografi, højtydende kapillærelektroforese og tyndlagselektroforese. Den mest anvendte metode er højtydende væskekromatografi, som nøjagtigt kan påvise indholdet af EGT fra komplekse materialesystemer. Højtydende væskekromatografi har dog sine åbenlyse mangler, det vil sige, at den skal udforske forskellige detektionsbetingelser for forskellige prøver. På grund af den sene spidsbelastningstid for EGT og de dyre standardprøver kan screening af prøver med højt udbytte fra et stort antal prøver i avl desuden føre til lang detektionstid og høje omkostninger, hvilket i høj grad hindrer udviklingen og anvendelsesforskningen af EGT. Derfor er det presserende at etablere en hurtig detektionsmetode med høj kapacitet, der nøjagtigt kan bestemme koncentrationen af EGT mellem prøver.
På grund af dets stærke antioxidantegenskaber og moderate reducerbarhed til divalente jernioner (hverken påvirket af kontakt med ilt i luften eller reduceret på grund af svag reducerbarhed) kan EGT reagere med divalente jernioner for at danne farveløse chelater, mens thiocyanationer reagerer med divalente jernioner for at danne røde komplekser. Baseret på disse egenskaber blev jernthiocyanat valgt som reduktionsmiddel i denne undersøgelse, og ergotaminstandard blev brugt til at reagere med jernthiocyanat for at etablere et detektionssystem med høj gennemstrømning for ergotamin. Samtidig blev high-throughput-detektionssystemet valideret ved at variere EGT-udbyttet af forskellige Ganoderma lucidum-stammer. Resultaterne af denne undersøgelse vil give nye metoder og ideer til screening af højtydende EGT-mikroorganismer og opdræt af nye højtydende EGT-stammer.

Baseret på ergothioneins stærkt reducerende fysisk-kemiske egenskaber blev der inden konstruktionen af EGT-tiocyanatjernsystemet udført eksperimenter med at konstruere alkalisk kaliumpermanganatsystem, bromokresolgrønt system, blå flaske methylenblåt system, guaiacolsystem og jernklorid EGT-system. Resultaterne viste, at det alkaliske kaliumpermanganatsystem mislykkedes på grund af lav stabilitet; Farveudviklingen af bromokresolgrønt system mislykkedes på grund af pH-afhængighed; I det blå flaske methylenblåt system, på grund af den stærke reducerbarhed af methylenblåt i reduceret tilstand, oxideres det også let til methylenblåt, når det kommer i kontakt med ilt i luften, hvilket resulterer i, at eksperimentet mislykkes uden noget fænomen; Guaiacol-systemet mislykkedes også på grund af stærk reducerbarhed og interferens fra iltkontakt; Jernchloridsystemet mislykkedes på grund af lav farvegengivelse. EGT-jernthiocyanatsystemet kan bruges til undersøgelse af detektionsmetoder med høj gennemstrømning for EGT.

Under konstruktionen af EGT-tiocyanatjerndetektionssystemet blev det konstateret, at resterende fenoliske stoffer i ekstraktionsopløsningen ville påvirke systemets farvereaktion og reducere dets følsomhed, når den testede prøve blev ekstraheret ved hjælp af den almindelige EGT-råekstraktionsmetode, nemlig alkoholudfældning kvælstofblæsende konstant volumenekstraktion. Derfor skal der efter nitrogenblæsning af konstant volumenekstraktion tilføjes et trin til fjernelse af chloroformphenol til råekstraktionsopløsningen.
Ganoderma lucidum er en traditionel og værdifuld medicinsk svamp i Kina, der indeholder forskellige bioaktive stoffer og fysiologiske funktioner. Dens indhold af ergothionein er relativt højt blandt mange spiselige svampe, men som en kommercielt produceret stamme er dens udbytte stadig lavt. Derfor er dyrkning af en ny stamme af Ganoderma lucidum med høj ergothionein-produktion af stor betydning og praktisk anvendelsesværdi. På baggrund af ovenstående har vores laboratorium opnået et parti pseudofusionsprodukter gennem regenerering, isolering og identifikation af protoplastfusion. De Ganoderma lucidum-fusionsprodukter, der anvendes i valideringsprocessen for denne metode, stammer alle fra denne kilde.
Metoden i denne undersøgelse er baseret på de fysiske og kemiske egenskaber ved selve EGT, og detektionssystemet er følsomt og stabilt. Det er velegnet til hurtig sammenligning af store mængder prøver i opdrætsprocessen af EGT-producerende industrielle fermenteringsstammer. I teorien er der kun behov for simpel optimering af EGT-ekstraktion af prøver for at opnå hurtig påvisning af EGT-indhold i langt de fleste stammer, hvilket bryder begrænsningerne i den oprindelige EGT-forskning og giver nye metoder og ideer til den overordnede udvikling og anvendelsesforskning af EGT.