Undersøgelse af fremme af trinvis berigelse af huperzin A ved symbiotisk dyrkningsmetode
Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) er en bregneplante i familien Taxaceae, der tilhører slægten Taxodium. Det er en sjælden kinesisk urtemedicin, der bruges til behandling af traumatiske skader, afgiftning, smertelindring og behandling af skizofreni. Slangefodsgran er i øjeblikket et af de bedst undersøgte lægemidler til behandling af Alzheimers sygdom. Dets aktive ingrediens, huperzin A, er en effektiv, lav toksicitet, reversibel og meget selektiv acetylcholinesterase (AChE)-hæmmer til behandling af myasthenia gravis og Alzheimers sygdom. Det kan øge virkningen af acetylcholin, en centralnervøs neurotransmitter, der er relateret til opmærksomhed, årvågenhed, koncentration og hukommelse. I 1982 lykkedes det at isolere huperzin A fra slangefodsgranen, og det blev betragtet som "håbets stjerne". Ifølge en undersøgelse vil antallet af patienter med Alzheimers sygdom på 65 år og derover i de udviklede lande nå op på 7,1 millioner i 2025, hvilket er en stigning på næsten 29% fra 5,5 millioner i 2018. Medmindre der sker et medicinsk gennembrud, kan antallet af patienter med sygdommen stige fra 5,5 millioner til 13,8 millioner i 2050. Alene i USA lider ca. 14-20 ud af hver 100.000 mennesker af myasthenia gravis, med i alt ca. 36.000-6.000 patienter, hvilket også er et meget alarmerende tal. Det største problem med de lægemidler, der i øjeblikket findes på markedet til Alzheimers sygdom og myasthenia gravis, er toksicitet og resistens. Sammenlignet med de nuværende lægemidler er huperzin A et naturligt planteekstrakt med god sikkerhed, færre bivirkninger og kan hurtigt absorberes af menneskekroppen. Inhiberingsmetoden er en blandet type konkurrencedygtig og ikke-konkurrencedygtig inhibering, og den terapeutiske virkning er signifikant med en lang effektiv tid.
Slangefods-Cryptomeria er udbredt over hele verden, men dens ressourcer er meget begrænsede. En af de begrænsende faktorer er den langsomme vækst af slangefods-cryptomeria, som tager mindst 15 år fra sporer til modenhed. Og i det modne stadie er højden på den slangefodede gran kun 10-30 cm. Samtidig er dens vækstmiljø vanskeligt at genskabe og vanskeligt at fremme i faktiske dyrkningsprocesser. Derfor vil den slangefodede gran i den nærmeste fremtid være truet af udryddelse. I de senere år er der gennemført flere undersøgelser af denne sjældne plante, f.eks. in vitro-dyrkning af eksploranter og callusvæv. Kan'ichiro Ishiuchis team har successivt startet fra H Eksplantaterne blev taget fra stængelspidsen af Pinifolia og dyrket i det sterile medium i 2 cyklusser (hver cyklus er 7 dage). Til sidst blev eksploranterne med succes overført til callus-vækstmediet. Forskerne foretog desuden forskellige forbedringer af dyrkningsmetoden for Huperzia serrata, f.eks. screening af mediekomponenter og forskning i teknologi til dyrkning af stængelspidser. Problemet med desinfektion og sterilisering af eksploranter i vævskulturprocessen er dog ikke blevet løst effektivt, hvilket begrænser produktionen af huperzin A i stor skala. På grund af knapheden på naturressourcer og de ovennævnte årsager er der et presserende behov for at finde en ny metode, der kan øge indholdet af huperzin A til en lavere pris.
Endofytiske svampe er en type svampe, der lever i planternes stængel- og bladvæv. Undersøgelser har vist, at hvis endofytiske svampe udvikler sig i symbiose med planter i lang tid, kan de få visse gener fra værtsplanten gennem genetisk rekombination og producere sekundære metabolitter, der er de samme som dem i værtsplanten. I mellemtiden kan endofytiske svampe også producere hormoner for at fremme vækst og udvikling af værtsplanter. I samdyrkningssystemet betragtes endofytiske svampe derfor som elicitorer, hvilket betyder, at planteceller kan samdyrkes med endofytiske svampe inden for et bestemt koncentrationsområde. I samdyrkningssystemet interagerer endofytiske svampe og planteceller med hinanden, hvilket fremmer ophobningen af planteprodukter. Ergosterol er en vigtig komponent i svampecellemembranen og en karakteristisk sterol for svampe. Det kan bruges som en repræsentativ indikator til at måle svampebiomasse.
Denne undersøgelse introducerer et nyt samdyrkningssystem (CCS) til økonomisk og praktisk at øge indholdet af huperzin A i kinesisk gran for at forbedre den nuværende situation, hvor kinesisk gran ikke kan bruges i vid udstrækning på grund af ressourceknaphed.

Huperzin A er en AChE-hæmmer, der bruges til behandling af Alzheimers sygdom og myasthenia gravis. Hovedkilden er Cryptomeria lanceolata, men indholdet af Huperzine A i Cryptomeria lanceolata er lavt, og de begrænsede ressourcer af Cryptomeria lanceolata begrænser den videre udvikling inden for det farmaceutiske område. Der er undersøgelser, der viser, at der findes forskellige endofytiske svampe i planter, som har dannet et komplekst mutualistisk forhold til deres værtsplanter i løbet af den langsigtede evolution. På den ene side er endofytiske svampe nødt til at optage næringsstoffer fra planter for at opfylde deres egne overlevelsesbehov. På den anden side indgår endofytiske svampe i en særlig biokemisk kommunikation med værtsplanter for at kunne modstå værtens forsvarssystem. De kan syntetisere sekundære metabolitter, der ligner værtens, ved at genkende værtens kemiske signaler eller anvende værtens enzymsystemer. Jiang et al. isolerede og rensede endofytiske svampe fra den halvrøde mangroveplante Hibiscus og opnåede de samme sekundære metabolitter som værten gennem solid state-fermentering. Tong et al. isolerede og undersøgte de sekundære metabolitter fra den endofytiske svamp FS4 i Cryptomeria serrata og fandt, at dens fem metabolitter udviste stærk hæmmende biologisk aktivitet af acetylcholinesterase svarende til huperzin A.
I denne undersøgelse blev der udført eksperimenter med domesticeringsbetingelserne og betingelserne for vævskulturmediet for vild snakefoot hemlock. De optimale dyrkningsbetingelser blev bestemt til at være en lysintensitet på 100 lux, en luftfugtighed på 95%, et flydende MS-medium, saccharose på 20,0 g/L, 2,4-D5,0 mg/L og KT1,0 mg/L. De relative ændringer af to forbindelser, huperzin A og ergosterol, blev brugt til at afspejle den dynamiske vækstproces af CCS. Den fjerde dag blev bestemt som det optimale tidspunkt for høst og subkultur baseret på dens bøjningspunkt. Efter 4 dages dyrkning med CCS steg indholdet af huperzin A med 49,34% og nåede sin maksimale værdi. Det samlede indhold af huperzin A i dyrkningssystemet viste en tendens til først at stige og derefter at falde. Det skyldes, at endofytiske svampe i det senere vækststadie har en stærkere reproduktionsevne end plantecellernes differentieringsevne og konkurrerer om næringsstoffer og vækstplads i kulturmediet, hvilket resulterer i et fald i antallet af celler. Derfor er valget af høst- og subkulturtidspunkt nøglen til at opnå en trinvis berigelse af huperzin A i samdyrkningssystemet. Samtidig har koncentrationen af plantehormonet 2,4-D en betydelig indvirkning på systemet. 2,4-D fremmer dedifferentieringen af planteorganer og induktion af callusvæv, men har en hæmmende effekt på celledifferentieringen, når koncentrationen er for høj. Derfor bruges 5 mg/L i dyrkningssystemet som den optimale koncentration. Dette eksperiment brugte med succes et samdyrkningssystem til at opnå biosyntese af huperzin A. Denne metode overvinder traditionelle faste koncepter, fordi plantesomatisk cellekultur ikke kræver grundig sterilisering på forhånd. Somatiske planteceller og endofytiske svampe kan dyrkes sammen, og produktionen af huperzin A kan fremmes i specifikke forhold. Så længe dyrkningscyklussen er nøjagtigt forstået, kan denne praktiske og hurtige metode bruges til at akkumulere huperzin A, hvilket er af stor betydning for at beskytte planteressourcer og berige de vigtige bioaktive stoffer i huperzin A.