Beskyttende effekt af chitosan-oligosakkarider på dextransulfat-induceret colitis hos mus
Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) omfatter colitis ulcerosa (UC) og Crohns sygdom (CD). Colitis ulcerosa blev opdaget af Wilk og Moxon i 1875, defineret af Boas og Wilk i 1903 og officielt udpeget som en særlig klinisk tilstand af WHO i 1905. Ulcerøs colitis er en uspecifik colitis, der hovedsageligt er lokaliseret i sigmoideum og rektum i tyktarmen. Læsionerne er kontinuerligt fordelt i mucosa og submucosa og kommer langsomt tilbage. Der er også nogle få tilfælde af akut debut, hovedsageligt manifesteret som mavesmerter, diarré og klæbrig afføring med pus og blod, ledsaget af forskellige ekstraintestinale symptomer. Den nøjagtige ætiologi og patogenese af ulcerøs colitis er stadig uklar, og det antages generelt at være relateret til forskellige faktorer såsom infektion, immunsystemforstyrrelser, genetisk følsomhed, miljø, mental tilstand og dysbiose. Det er meget almindeligt i vestlige lande, hvor 10-20 mennesker lider af det for hver 105 mennesker, og forekomsten i Nordamerika og Vesteuropa er højere. I de senere år har forekomsten af UC i Kina også været stigende. På nuværende tidspunkt findes der symptomatiske lægemidler som 5-aminosalicylsyre (sulfasalazin) og immunosuppressive midler til behandling af colitis, men de har visse bivirkninger, hvilket gør søgningen efter sikre lægemidler til et hotspot for forskningen.
Chitooligosaccharider (COS) fremstilles ved hydrolyse af chitosan (CS) med en polymerisationsgrad på 2-20 og en gennemsnitlig molekylvægt på mindre end 3900 Da. Molekylvægten er lille, letopløselig i vand og kan absorberes direkte af biologiske organismer. Det har biologiske aktiviteter såsom at reducere fedt, sænke blodsukkeret, hæmme bakterier, bekæmpe kræft og antiinflammatorisk og har ingen toksiske bivirkninger. Det kan bruges i vid udstrækning inden for forskellige områder som medicin, kosmetik, fødevarer og landbrug. Chitosan kan fremstilles ved deacetylering af chitin, den næstmest udbredte polymer i verden efter cellulose (som ofte findes i krebsdyrsskaller, insekthud og svampecellevægge). På nuværende tidspunkt har der været nogle undersøgelser af chitosan-oligosakkariders virkning på colitis, såsom Yang et al.s opdagelse af, at chitosan-oligosakkarider kan opnå beskyttende virkninger på colitis gennem AMPK og NF-κ B. Anvendelseskoncentrationen er dog betydeligt højere (generelt 500 mg/kg, svarende til en menneskedosis på ca. 3,6 g), hvilket langt overstiger den nationale anbefalede indtagelsesdosis på 0,5 g/dag (se Announcement on the Approval of Six New Food Ingredients including Chitosan Oligosaccharides (2014 No. 6), svarende til en musedosis på 70 mg/kg). Yousef fandt ud af, at chitosanoligosaccharider i en dosis på 20 mg/kg også kan have en beskyttende effekt på colitis ved hjælp af en colitis-model med eddikesyreinfusion og eksperimenter med tarmepitelceller. Derfor bruger denne artikel hovedsageligt en 3% DSS drikkevandsinduceret colitis musemodel til at verificere interventionen af chitosan oligosaccharider på colitis i forskellige doser (70 og 140 mg/kg), udforske chitosan oligosacchariders rolle i regulering af colitis symptomer og fysiologisk status hos mus, og give data støtte til yderligere forskning i den beskyttende virkning af chitosan oligosaccharider på DSS induceret colitis mus. I dette eksperiment blev 50 han-C57BL/6-mus tilfældigt opdelt i 5 grupper: blank gruppe, modelgruppe, positiv gruppe (SASP, 50 mg/kg) og lav- og højdosis chitosangrupper (70 og 140 mg/kg) ved at drikke vand indeholdende 3% natriumdextransulfat (DSS) i 7 dage for at etablere en model. Evaluere effekten af chitooligosaccharider gennem vægtændringer, sygdomsaktivitetsindeks, patologisk score og myeloperoxidaseaktivitet. Påvise niveauerne af inflammatoriske faktorer i colitis ved hjælp af ELISA.

DSS colitis-modellen er en internationalt anerkendt og udbredt eksperimentel UC-dyremodel, der blev etableret i 1990. Dens patologiske ændringer omfatter sårdannelse, kryptabcess, betændelse i små kar, nedsat antal bægerceller og infiltration af forskellige inflammatoriske celler, som svarer til de kliniske symptomer på colitis hos mennesker. Den anbefalede dosis af chitosan til mennesker er 0,5 g pr. person, hvilket kan omregnes til en dosis til mus på 70 mg/kg. Ved hjælp af denne model valgte vi derfor to doser chitosan, 70 mg/kg og 140 mg/kg, for at undersøge deres virkning på DSS-induceret colitis. I koreansk litteratur blev der udført eksperimenter med akut toksicitet af oligosakkarider, og man fandt, at LD50 for oligosakkarider i mus oversteg 5,0 g/kg. Zhao et al.s sikkerhedsevaluering af funktionelle chitosan-fødevarer viste, at der ikke blev observeret nogen akutte toksiske reaktioner inden for 10 dage efter indgivelse til mus (1,25 g/kg/dag) og rotter (1,47 g/kg/dag) (ca. 312-368 gange den klinisk anbefalede dosis). Dette forsøg etablerede en model for colitis ulcerosa ved at lade musene drikke 3% DSS frit i 7 dage. På forsøgets sjette dag blev der observeret typiske fysiologiske symptomer på colitis hos musene i modelgruppen, såsom vægttab, appetitløshed, ujævn behåring, diarré, klistret afføring med blod og endda rektal blødning. På den ottende dissektionsdag blev det konstateret, at tyktarmen hos musene i modelgruppen var forkortet, og tyktarmsvævet var overbelastet og ødematøst. HE-farvning afslørede ødem i tyktarmens slimhinde, ufuldstændige epitelceller, forsvinden af kryptkirtelstruktur og alvorlig inflammatorisk infiltration. Ovenstående symptomer blev forbedret hos mus, der blev behandlet med lavdosis (70 mg/kg) og højdosis (140 mg/kg) chitosan. I overensstemmelse med resultaterne fra Yousef et al. påpegede han, at chitosan-oligosakkarider kan reducere apoptose af tarmepitelceller, hæmme inflammation og beskytte den strukturelle og funktionelle integritet af tarmepitelbarrieren. Nogle undersøgelser tyder på, at inflammatorisk tarmsygdom er forårsaget af defekter i tarmepitelbarrieren og dysregulering af slimhindeimmunrespons. Chitosan-oligosakkarider kan beskytte tarmepitelceller, hvilket indikerer deres vigtige beskyttende rolle i enteritis. I dette forsøg viste chitosan-dosisgruppen på 70 mg/kg signifikante forskelle i forhold til modelgruppen med hensyn til at forbedre forkortelsen af tyktarmen, lindre slimhindeødem i tyktarmen og beskytte bægerceller og kryptstrukturer. Dosisgruppen på 140 mg/kg viste dog ingen signifikant forskel i forbedringen af tyktarmsforkortelsen sammenlignet med modelgruppen, og der var kun en signifikant forskel i forbedringen af de patologiske vævsscorer. Dette indikerer, at lavdosis chitosan-gruppen har en bedre beskyttende effekt på DSS-induceret colitis hos mus. Resultaterne viste, at en dosis på 70 mg/kg chitosan havde en vis effekt på lindring af tyktarmsforkortelse og beskyttelse af tyktarmsstrukturen hos mus, hvilket er nyttigt for udviklingen og anvendelsen af chitosan i den nationalt anbefalede dosis.

På nuværende tidspunkt er de vigtigste behandlingsretninger for IBD oxidativ stress og inflammation. Det antages, at oxidativ stress er det patogene grundlag for IBD, og overdrevne iltfrie radikaler er en nøglefaktor i dannelsen af ulcerativ inflammatorisk vævsskade og colitis. Med produktionen af MDA genererer overdreven NO iltfrie radikaler, der forårsager oxidativ skade og fører til infiltration af et stort antal inflammatoriske celler i vævet. Neutrofiler er de hurtigste immunceller, der rekrutteres til inflammationsstedet i de tidlige stadier af UC. De har en dobbelt funktion. På den ene side samler de sig i epitelkrypter og tarmhulrum og udskiller IL-1, IL-6, MPO osv. ved at frigive reaktive iltarter (ROS), hvilket medfører yderligere vævsskade. På den anden side opretholder det aktivt vævshomeostase ved at udskille antiinflammatoriske faktorer og kan begrænse mikrobiel invasion. Qiao et al. fandt ud af, at chitosan-oligosakkarider kan reducere infiltrationen af neutrofiler og lipidperoxidation i beskadigede organer i musemodeller med LPS-induceret sepsis. Dou et al. fandt, at chitosanoligosaccharider kan hæmme produktionen af reaktive iltarter, degranulering og vedhæftning af aktiverede neutrofiler hos kaniner og derved udøve antiinflammatoriske virkninger. Myeloperoxidase-værdien (MPO) er en markør for vævsskade og neutrofil (PMN)-infiltration, som kan føre til brud på slimhinden og sårdannelse og er tæt forbundet med IBD.

I eksperimentet blev MPO-aktiviteten i colitis-modelgruppemusene signifikant øget sammenlignet med den blanke gruppe, hvilket indikerer en signifikant stigning i neutrofiler i tarmvæv og alvorlig infiltration. Efter intervention med chitosanoligosaccharid faldt MPO-aktiviteten i tyktarmsvævet, selvom den ikke var signifikant forskellig fra modelgruppen, var der en tendens til at bremse neutrofil aggregering i tarmen og reducere yderligere vævsskade. Dette stemmer overens med Dou et al.s opdagelse af, at chitosan-oligosakkarider kan fremme neutrofil apoptose og reducere MPO-frigivelse hos mus med glykogen peritonitis. Det spekuleres i, at dette kan være relateret til aktiveringen af PLD og PI3K, som inducerer neutrofil produktion af superoxid og andre stoffer.

UC er resultatet af flere faktorer, der arbejder sammen, og blandt disse spiller cytokiner også en vigtig rolle. IL-6 kan stimulere T-celleproliferation ved lave koncentrationer, aktivere B-celleproliferation, udskille antistoffer og deltage i kroppens inflammatoriske respons ved høje koncentrationer. TNF-α, også kendt som tumornekrosefaktor alfa, produceres af aktiverede makrofager II-monocytter og fremmer apoptose. IL-6 og TNF - α, som er to vigtige inflammatoriske cytokiner, er de hurtigste og mest betydningsfulde inflammatoriske faktorer, der reagerer på patogene stimuli i kroppen. De er almindeligt forekommende i forskellige patologiske processer som immunsygdomme, inflammatoriske reaktioner og tumorimmunitet. I colonslimhindevævet hos UC-patienter er udtrykket af IL-6 og TNF-α meget højere i den aktive fase end i remissionsfasen, og de spiller også vigtige roller i inflammation og immunrespons i tarmslimhinden og betragtes som nøglecytokiner, der medierer IBD. Nuklear faktor kappa B (NF - κ B) er en vigtig transkriptionsfaktor, der er relateret til udtrykket af inflammatoriske cytokiner. Når kroppen stimuleres, kan I κ B aktiveres og nedbrydes, hvilket aktiverer NF - κ B i cytoplasmaet og kommer ind i kernen, inducerer gentranskription og genererer forskellige inflammatoriske eller kemokiner, såsom IL-1 β, IL-6, IL-12 og TNF - α, som yderligere forværres gennem feedbackforstærkning. Youself et al. mener, at chitooligosaccharider lindrer betændelsesreaktioner i kroppen ved at hæmme NF - κ B-vejen. I dette eksperiment blev udtrykket af IL-6 og TNF - α i tyktarmsvævet hos ulcerøs colitis-mus øget betydeligt, mens intervention med lave og høje doser af chitosan-oligosaccharider kunne reducere deres ekspressionsniveauer betydeligt, hvilket stemmer overens med resultaterne fra Yang og Youself et al. Det indikerer, at oligosaccharider effektivt kan forbedre colitis-symptomer ved at lindre inflammatoriske reaktioner.

Ved at sammenligne de eksperimentelle resultater af to doser chitosan-oligosakkarider fandt man ud af, at begge doser chitosan-oligosakkarider bremsede DSS-induceret vægttab, forkortelse af tyktarmen og hæmmede sygdomsaktivitetsindekset samt øgede MPO-aktiviteten. De forbedrede de histopatologiske forandringer markant og øgede niveauerne af TNF-α og IL-6 i vævet. Blandt dem havde lavdosisgruppen og højdosisgruppen bedre effekt i forhold til at lindre tyktarmens længde og histopatologiske forandringer. Dette indikerer, at lavdosisgruppen af COS har en bedre effekt i forhold til at lindre symptomer på colitis. Yousef et al. behandlede colitis-mus med COS i doser på 1, 5, 10, 20, 50 og 100 mg/kg og fandt ud af, at 10 og 20 mg/kg COS havde den bedste effekt. Lignende klokkeformede forhold mellem COS-dosis og effekt blev også observeret i T84-celler induceret af LPS og TNF - α, hvilket tyder på, at COS kan stimulere to forskellige signalveje, producere modsatte effekter og forårsage funktionel antagonisme. Forholdet mellem dosiseffekt blev også fundet i tidligere undersøgelser i vores laboratorium. Ding gav COS i doser på 35, 70, 140 og 210 mg/kg til mus med alkoholisk fedtlever og fandt, at grupperne på 70 og 140 mg/kg havde en bedre beskyttende effekt. De 70 og 140 mg/kg COS, der er valgt i denne artikel, kan være placeret i midten og bagsiden af klokkeformen, og de eksperimentelle resultater viser, at lavdosisgruppen har lidt bedre effekter end højdosisgruppen.

Sammenfattende kan chitosan-oligosaccharider effektivt lindre symptomer på DSS-induceret colitis. Blandt dem er 70 mg/kg chitosanoligosaccharider mere effektive til at lindre tyktarmens længde og histopatologiske ændringer sammenlignet med 140 mg/kg, og de er mere velegnede som den anbefalede dosis til menneskebrug. I mellemtiden kan chitosanoligosaccharider spille en rolle i at reducere inflammation og lindre IBD-symptomer ved at lindre neutrofil infiltration og hæmme frigivelsen af pro-inflammatoriske cytokiner. Den specifikke virkningsmekanisme for chitooligosaccharider til at hæmme frigivelsen af inflammatoriske cytokiner skal dog stadig verificeres yderligere.