Foreløbig undersøgelse af den beskyttende effekt af icariin, der aktiverer Nrf2-signalvejen mod D-galactose-induceret skade i musens testikulære Sertoli 15P-1-celler
Med den fortsatte udvikling af økonomien og samfundet og det stigende pres på folks overlevelse er infertilitet blevet et globalt problem. Forskning har vist, at omkring 15% af par på verdensplan lider af infertilitet, hvor mandlige faktorer tegner sig for omkring 50%, og mekanismen er endnu ikke fuldt ud forstået. Testikulære Sertoli-celler, som er de eneste somatiske celler, der er forbundet med spermatogene celler, omgiver strukturelt spermatogoniale stamceller, spermatogonier og forskellige niveauer af spermatogene celler og danner en blodtestisbarriere gennem forskellige tight junction-proteiner såsom Occludin og Claudin-1. Forskning har vist, at testikulære støtteceller udskiller forskellige vækstfaktorer som glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF), bone morphogenetic protein-4 (BMP4) og stem cell factor (SCF), som regulerer spredning og differentiering af spermatogoniale stamceller og fremmer dannelsen af sædceller. En anden undersøgelse viste, at hanrotter udsat for hexavalent krom under graviditeten viste nedregulering af udtrykket af tight junction-proteinerne Occludin og Claudin-1 i støttecellerne efter voksenalderen, hvilket førte til øget apoptose af spermatogene celler og nedsat sædproduktion. Under varmestress-stimulering beskadiges Sertoli-cellerne i kvægs testikler, og GDNF- og SCF-mRNA-niveauerne nedreguleres, hvilket fører til sæddysfunktion. Derfor kan en forbedring af støttecellernes struktur og funktion være en ny vej til behandling af mandlig infertilitet.

Epimedium er en traditionel kinesisk lægeurt med nærende egenskaber, som første gang er beskrevet i "Shennong Bencao Jing". Den har den virkning, at den styrker nyrernes yang, styrker muskler og knogler og fordriver vind og fugt. Moderne farmakologisk forskning har vist, at epimedium har en betydelig effekt i forhold til at forsinke aldring og forbedre den mandlige forplantningsfunktion. Den vigtigste aktive ingrediens er icariin (ICA). Undersøgelser har vist, at ICA kan fremme spredningen af primære Sertoli-celler hos rotter og forbedre funktionen af mandlige Sertoli-celler. Forskning har vist, at ICA kan forbedre rotters reproduktive funktion ved at øge mRNA-ekspressionsniveauerne af follikelstimulerende hormonreceptorer og tight junction-proteinet Claudin-11 i støtteceller og derved forbedre testikelvævets antioxidante stressresistens. Nuclear factor erythroid like 2 (Nrf2), som er den vigtigste regulator af kroppens cellulære forsvarssystem, regulerer udtrykket af en række gener, der koder for antioxidantproteiner og oxidative stressresponsproteiner ved at binde sig til enhancer-sekvenser i promotorreguleringsområdet for antioxidantresponselementer (ARE), koordinere finjustering af reaktioner på forskellige stressforhold og skadelige angreb og opnå cellulær mikromiljøhomeostase. Forskning har vist, at Epimedium kan lindre oxidativ stress-induceret leverskade ved at aktivere Nrf2. Vores tidligere forskning viste, at ICA kan afhjælpe DNA-skader i testikelkimceller fra naturligt aldrende rotter ved at opregulere Nrf2. ICA kan opregulere proteinudtrykket af de tight junction-relaterede proteiner Occludin og Claudin-1 i musens testikelstøttecellelinje TM4 induceret af D-Gal. Der er dog i øjeblikket ingen forskningsrapport om, hvorvidt ICA kan forbedre D-Gal-induceret 15P-1-cellebeskadigelse gennem Nrf2-signalvejen. Tidligere undersøgelser har vist, at D-Gal kan fremkalde skader på tight junction i musens testikelbærende cellelinje TM4-celler. Derfor brugte dette eksperiment D-galactose (D-Gal) - inducerede 15P-1-celler som en skadesmodel for at undersøge den beskyttende virkning og mekanisme af ICA på Sertoli-celleskader fra Nrf2-signalvejen.

I de senere år er infertilitet blevet anerkendt som et folkesundhedsproblem af WHO. Forekomsten af infertilitet i den generelle befolkning er steget år for år og påvirker omkring 15% af par i den fødedygtige alder i verden. Forskning viser, at i USA og andre vestlige lande falder antallet af sædceller med 1,5% om året, og det anslås, at næsten 70 millioner par verden over er blevet ofre for infertilitet eller sterilitet. En stor epidemiologisk undersøgelse foretaget af WHO viste, at omkring halvdelen af parrenes infertilitet skyldes mandlige faktorer, og mekanismen er endnu ikke fuldt ud forstået.

Forskning har vist, at D-Gal kan reducere antallet og funktionen af musens støttecellelinje TM4-celler. Derfor valgte vi D-Gal-modellen til at evaluere, om ICA kan afhjælpe 15P-1-celleskader. Der er litteraturrapporter om, at efter behandling med 35, 70 og 140 μ M ICA på endotelceller ECV-304 var celleinhiberingshastigheden 1,2%, og der var ingen signifikant cytotoksicitet. MTT-resultaterne af dette eksperiment viste, at sammenlignet med kontrolgruppen, da ICA blev brugt alene til at behandle 15P-1-celler, var IC50 større end 50% ved en koncentration på 40 μ M, hvilket indikerer, at ICA ikke havde nogen signifikant cytotoksicitet. Vores foreløbige forskning viste, at ICA har en beskyttende effekt på TM4-celleskader behandlet med D-Gal og har en signifikant proliferativ effekt ved koncentrationer på 0,5 og 1 μ M. MTT-resultaterne af dette eksperiment viste også, at sammenlignet med D-Gal-behandlingsgruppen øgede ICA celleoverlevelsesraten på en koncentrationsafhængig måde ved 0,125-1 μ M og havde en signifikant fremmende effekt på celleproliferation ved koncentrationer på 0.5 og 1 μ M. Den fremmende effekt af ICA blev svækket, når koncentrationen var større end 1 μ M, hvilket kan skyldes den længere stimuleringstid af D-Gal på 15P-1-celler i dette eksperiment, mere alvorlig celleskade og stærkt øget følsomhed af beskadigede celler over for lægemiddelstimulering, hvilket udviser et fænomen med lavkoncentrationsfremme og højkoncentrationshæmning. Testikulære Sertoli-celler er somatiske celler placeret i testiklernes seminiferøse tubuli, der er direkte forbundet med spermatogene celler. De regulerer spredningen og differentieringen af spermatogoniale stamceller og fremmer sæddannelsen ved at udskille forskellige cytokiner som GDNF, BMP4 og SCF. GDNF er medlem af den transformerende vækstfaktor beta-superfamilie og en vigtig faktor i reguleringen af proliferationen af spermatogoniale stamceller. Den spiller en afgørende rolle i udviklingen af mandlige kønsceller og den tidlige testikeludvikling. BMP4 og SCF er vigtige faktorer, der fremmer differentieringen af spermatogoniale stamceller. Tidligere forskning fra vores forskningsgruppe har vist, at totale flavonoider af Epimedium kan opregulere mRNA- og proteinniveauerne af GDNF, BMP4 og SCF, der udskilles af Sertoli-celler i naturligt aldrende rottetestikler, hvilket forbedrer Sertoli-celleudskillelsesfunktionen. Resultaterne viste, at sammenlignet med kontrolgruppen blev mRNA- og proteinekspressionsniveauerne af Sertoli-celleudskilte faktorer signifikant reduceret efter D-Gal-behandling, mens mRNA- og proteinekspressionsniveauerne af Sertoli-celleudskilte faktorer blev signifikant opreguleret i 15P-1 efter ICA-behandling. ICA kan forbedre sekretionsfunktionen af 15P-1 testikulære Sertoli-celler.

De tætte forbindelser mellem støtteceller er den vigtigste komponent i blodtestisbarrieren, hovedsageligt inklusive de tre transmembrane proteinfamilier Occludin, Claudin og adhæsionsproteiner samt den cytoplasmatiske proteinfamilie i det blokerende kryds. De tætte forbindelser mellem cellerne beskytter ikke kun reproduktive celler mod invasion af immunsystemet og giver et godt fysiologisk miljø for spermatogenese, men gør det også muligt for pre fine og post fine spermatocytter at passere gennem blodtestisbarrieren regelmæssigt for yderligere udvikling. Forskning har vist, at Occludin og Claudin er de tidligst identificerede tight junction-membranproteiner, og at tight junction-evnen og epitelbarrierefunktionen hovedsageligt formidles af Claudin. En anden undersøgelse har vist, at indsprøjtning af syntetisk Occludin-peptid i rottetestikler reversibelt kan fjerne de fleste spermatogonier efter 27 dage, mens knock-out af Occludin in vitro også kan føre til et fald i støttecellernes tight junction-funktion. Resultaterne af dette eksperiment viste, at sammenlignet med kontrolgruppen faldt udtrykket af tight junction-protein i 15P-1-celler efter D-Gal-behandling, mens udtrykket af tight junction-protein i 15P-1-støtteceller blev signifikant opreguleret efter ICA-behandling. ICA har en beskyttende virkning på skader på tight junction-protein i 15P-1-støtteceller.

Når kroppen er i normal tilstand, rekrutterer Kelch like ECH associated protein-1 (Keap1) Nrf2 og danner et kompleks i cytoplasmaet, der nedbrydes af ubiquitinprotease; Når der opstår oxidativ stress, dissocieres Nrf2 fra Keap1, og Nrf2 overføres fra cytoplasmaet til kernen for at binde sig til ARE, hvilket aktiverer transkriptionen af downstream-beskyttende gener som HO-1 og NQO1 og derved modstår oxidativ stressskade forårsaget af forskellige stimuli i kroppen. Vores tidligere forskning har vist, at ICA kan afhjælpe testikel-DNA-skader hos naturligt aldrende rotter og forbedre nedgangen i forplantningsfunktionen forårsaget af aldring ved at aktivere Nrf2/HO-1-signalvejen. Dette tyder på, at ICA's forbedring af spermatogen dysfunktion kan være relateret til Nrf2-signalvejen. Tidligere undersøgelser har vist, at ICA kan forbedre D-Gal-induceret testikelstøttecellelinje TM4-celleskade. Derfor brugte denne undersøgelse Western blot til at detektere Nrf2-vejproteiner. Resultaterne viste, at sammenlignet med kontrolgruppen blev ekspressionsniveauerne for vigtige Nrf2-vejproteiner Nrf2, HO-1 og NQO-1 i 15P-1-celler signifikant nedreguleret efter D-Gal-stimulering, mens de blev signifikant forøget efter ICA-administration. Efterfølgende påviste vi yderligere ekspression og lokalisering af Nrf2 ved hjælp af immunofluorescens-teknologi. Sammenlignet med den normale kontrolgruppe var fluorescensudtrykket af Nrf2 i kernen af 15P-1-celler i D-Gal-behandlingsgruppen svækket, men forbedret efter ICA-behandling. Ovenstående resultater tyder på, at den funktionelle og strukturelle skade på 15P-1-celler er relateret til nedreguleringen af Nrf2-signalvejen, hvilket fører til et fald i den cellulære antioxidantkapacitet. ICA kan forbedre skaderne på 15P-1-celler ved at øge deres antioxidantkapacitet.

Sammenfattende kan ICA opregulere ekspressionsniveauerne af sekretionsrelaterede proteiner GDNF, BMP4, SCF samt tight junction-relaterede proteiner Occludin og Claudin-1 i 15P-1-celler ved at aktivere Nrf2-signalvejen og derved forbedre D-Gal-inducerede skader i 15P-1-celler. Dette eksperiment har lagt et teoretisk fundament for vores efterfølgende forskning i ICA's beskyttende virkning og mekanisme på kønsceller for bedre at kunne udforske anvendelsesværdien af kinesisk urtemedicin Epimedium i forplantningssystemet og give nye retninger for den kliniske behandling af mandlig infertilitet.