Effekten af sulforaphan på Nrf2-medieret antioxidantkapacitet i skeletmuskulaturen hos mus udsat for akut hypotermi
Skeletmuskulaturen er et vigtigt organ for varmeproduktion i kroppen under lave temperaturer. Skeletmusklerne opretholder kroppens temperaturhomeostase gennem både rystende og ikke rystende varmeproduktion i miljøer med lave temperaturer. Denne proces kræver hydrolyse af en stor mængde ATP for at omdanne den kemiske energi til kroppens nødvendige termiske energi. Skeletmuskler opfylder hovedsageligt behovet for varmeproduktion ved at øge hastigheden af fedtsyreoxidation og nedbrydning i miljøer med lave temperaturer, mens stigningen i mitokondriernes fedtsyreoxidationshastighed ledsages af en øget produktion af reaktive iltarter (ROS). Tidligere undersøgelser har vist, at akut eller langvarig eksponering for lave temperaturer øger hvilestofskiftet og ROS-niveauerne i skeletmuskulaturen hos mus. Stigningen i ROS-niveauer kan forårsage oxidativ skade på skeletmuskelproteiner, nukleinsyrer og lipider og derved påvirke den motoriske ydeevne og genopretning af skeletmuskler. Derfor er rettidig fjernelse af den store mængde ROS, der produceres af skeletmuskler i lavtemperaturmiljøer, og forbedring af deres antioxidantkapacitet afgørende for at opretholde deres normale fysiologiske funktioner.
Det antioxidante forsvarssystem, der medieres af den nukleare faktor E2-relaterede faktor 2 (Nrf2), spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af den cellulære redox-homøostase. Når celler er under oxidativ stress, bliver Nrf2 i cytoplasmaet ikke ubiquitineret eller nedbrudt af sit negative reguleringsprotein, Kelch like cyclooxygenase related protein-1 (Keap1). Det går ind i kernen og binder sig til antioxidantresponselementer (ARE) på adskillige genpromotorer, opregulerer udtrykket af de fleste antioxidantenzymer og fase II-afgiftningsenzymer og udøver en beskyttende effekt mod oxidativ stress i kroppen. Undersøgelser har imidlertid vist, at akut eller langvarig eksponering for lave temperaturer reducerer udtrykket af Nrf2-mRNA og -protein i musens hjerte-, lever- og lungevæv og -organer betydeligt, hvilket indikerer, at miljøer med lave temperaturer kan hæmme udtrykket af Nrf2 i væv og organer. Der er dog ingen rapporter fra ind- og udland om, hvorvidt akut eksponering for hypotermi også hæmmer Nrf2-ekspression og antioxidantkapacitet i skeletmuskler.

Sulforafan (SFN) findes i rigelige mængder i korsblomstrede planter og er anerkendt som en specifik aktivator af Nrf2. Derfor forsøger denne undersøgelse først at observere virkningerne af akut hypotermi-eksponering i forskellige varigheder på 1 time og 3 timer på udtrykket af Nrf2 og antioxidantenzymer samt antioxidantkapacitet i musens skeletmuskulatur; baseret på dette blev virkningerne af at administrere SFN før lavtemperatureksponering på det Nrf2-medierede antioxidantenzymsystem og glutathion-redox-homøostase i skeletmuskulaturen yderligere udforsket. Denne undersøgelse vil give foreløbige eksperimentelle beviser for at udforske muligheden for SFN som et sportsernæringstilskud i miljøer med lave temperaturer.

Nrf2 er en central reguleringsfaktor, der opretholder redox-homøostasen i skeletmuskulaturen. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at eksponering for lav temperatur hæmmer Nrf2-ekspression i væv og organer som hjerte, lever og lunger, hvilket fører til en stor produktion af ROS i disse organer, som ikke kan fjernes. Der har dog ikke været nogen rapporter om virkningerne af akut hypotermi-eksponering på Nrf2-ekspression og antioxidantkapacitet i skeletmuskler. Derfor undersøgte denne undersøgelse først virkningerne af 1 og 3 timers eksponering for lav temperatur på det Nrf2-medierede antioxidantsystem i skeletmuskler. Resultaterne viste, at transkriptionsniveauet af Nrf2 mRNA i skeletmuskulaturen hos mus, der blev udsat for 3 timers lav temperatur, blev reduceret betydeligt, mens niveauet af ROS blev øget betydeligt. Efterfølgende eksperimentelle resultater viste også, at sammenlignet med PBS+Con-gruppen viste udtrykket af Nrf2-protein i skeletmuskulaturen hos mus i PBS+Cold-gruppen en faldende tendens, og niveauet af T-AOC blev markant reduceret, mens niveauet af ROS viste en stigende tendens. Det antages, at 3-timers lavtemperatureksponering kan hæmme udtrykket af Nrf2 i musens skeletmuskulatur og reducere dens antioxidantkapacitet.

Eksponering for lav temperatur i 3 timer reducerer skeletmuskulaturens antioxidantkapacitet, hvilket kan være relateret til hæmning af Nrf2-medieret antioxidant enzymekspression og glutathion redox homeostase. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at 3 timers eksponering for akut hypotermi kan reducere SOD1-ekspressionen i musenyrer, lungevæv og brunt fedtvæv betydeligt. Intermitterende lavtemperatureksponering (8 timer om dagen i 3 dage) reducerede GPX1-aktiviteten og HMOX1-proteinekspressionen i rottelungevæv betydeligt. Langvarig lavtemperatureksponering (4 timer om dagen, 6 dage om ugen, i alt 2 uger) reducerede SOD1-aktiviteten og CAT-proteinekspressionen i musehjernevæv markant. Denne undersøgelse viste, at mRNA-transkriptionsniveauerne af antioxidantenzymgener (Gpx1, Hmox1, Cat, Sod1, Nqo1) i musenes skeletmuskler i 3 timers-gruppen var signifikant reduceret sammenlignet med 0- og 1 timers-grupperne. Efterfølgende eksperimentelle resultater viste også, at sammenlignet med PBS+Con-gruppen viste mRNA-transkriptionsniveauerne af antioxidante enzymgener (Gpx1, Hmox1, Cat, Sod1, Nqo1) i skeletmuskulaturen hos mus i PBS+Cold-gruppen en faldende tendens, og udtrykket af HMOX1- og CAT-proteiner blev markant reduceret. Det kan udledes, at 3-timers lavtemperatureksponering kan hæmme transskriptionen og translationen af Nrf2-medierede antioxidantenzymer og derved påvirke skeletmuskulaturens antioxidantkapacitet. Desuden har undersøgelser vist, at akut lavtemperatureksponering kan reducere GSSG-indholdet og GSH/GSSG-forholdet i røde blodlegemer hos mennesker samt reducere GSH-indholdet i rottelever og mavevæv. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at sammenlignet med PBS+Con-gruppen steg og faldt skeletmuskulaturens GSSG-indhold og GSH/GSSG-forholdet hos mus i PBS+Cold-gruppen signifikant, mens GSH-indholdet ikke ændrede sig signifikant. Det tyder på, at ophobningen af GSSG kan være hovedårsagen til faldet i GSH/GSSG-forholdet.

Den specifikke aktiveringseffekt af SFN på Nrf2 er blevet bredt bekræftet. En undersøgelse viste, at en 12-ugers SFN-kostintervention aktiverede det Nrf2-regulerede antioxidante enzymsystem i extensor digitorum longus-musklen hos ældre mus, hvilket forbedrede muskelstyrken og træningsudholdenheden. Derudover fik rotter en intraperitoneal indsprøjtning med SFN tre dage før udmattelsestræning, hvilket resulterede i et fald i plasma-laktatdehydrogenase og kreatinphosphokinase-aktivitet samt en stigning i Nrf2- og antioxidantenzym (NQO1, GST, GSR) proteinudtryk og -aktivitet i den laterale lårmuskel. Tiden og distancen fra træning til udmattelse steg også. Ovenstående forskningsresultater indikerer, at SFN-aktivering af Nrf2 spiller en vigtig rolle i forbedringen af dens medierede antioxidantkapacitet og træningsudholdenhed. For at forbedre faldet i skeletmuskulaturens antioxidantkapacitet under 3 timers lavtemperatureksponering supplerede vi derfor mus med SFN før 3 timers lavtemperatureksponering. De eksperimentelle resultater viste, at sammenlignet med PBS+Cold-gruppen viste musene i SFN+Cold-gruppen en signifikant stigning i Nrf2-mRNA- og proteinudtryk i skeletmuskulaturen samt T-AOC og et signifikant fald i ROS-niveauer. Husk på det: SFN-aktivering af Nrf2 kan øge T-AOC i skeletmuskler, der udsættes for lav temperatur i 3 timer, eliminere overdreven ROS og have en positiv effekt på opretholdelsen af redox-homøostasen i skeletmuskler.

Tilskud af SFN forbedrer antioxidantkapaciteten i skeletmuskler hos mus, der udsættes for lave temperaturer, hvilket er tæt forbundet med aktiveringen af Nrf2-medieret antioxidant enzymsystem af SFN. De endogene antioxidantenzymer, der reguleres af Nrf2, er de vigtigste eksekutorer af ROS-clearance. For eksempel katalyserer SOD1 dismutationen af superoxidanionradikaler for at generere ilt og hydrogenperoxid; CAT kan dismutere hydrogenperoxid til vand og ilt; GPX1 katalyserer genereringen af vand og tilsvarende alkoholer fra hydrogenperoxid eller organiske peroxider ved hjælp af GSH som substrat; NQO1 katalyserer den dobbelte elektronreduktionsreaktion af quinon for at danne hydroquinon, fremmer quinonudskillelse og forhindrer quinon i at generere ROS gennem enkeltelektronreduktionsreaktion; HMOX1 katalyserer nedbrydningen af giftigt frit hæmoglobin for at producere biliverdin, CO og jernholdige ioner med antioxidantskadefunktioner. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at indgivelse af SFN før 3 timers lavtemperatureksponering signifikant øgede mRNA-transkriptionsniveauerne af skeletmuskelantioxidantenzymgener (Gpx1, Hmox1, Cat, Sod1, Nqo1) og proteinudtrykket af HMOX1 og SOD1 hos mus i SFN+Kold-gruppen sammenlignet med PBS+Kold-gruppen. Ovenstående resultater indikerer, at SFN-aktivering af Nrf2 forbedrer transskriptionen og translationen af disse antioxidantenzymgener.

Desuden øger tilskud af SFN antioxidantkapaciteten i skeletmuskulaturen hos mus, der udsættes for lave temperaturer. Ud over øget ekspression af antioxidantenzymer er det også tæt forbundet med SFN-aktivering af det Nrf2-medierede glutathion-redoxsystem. Glutathion er et tripeptid, der består af glutaminsyre, cystein og glycin, og er et vigtigt lille molekyleaktivt oligopeptid i organismers antioxidantforsvarssystem. Glutathion findes hovedsageligt i form af GSH i celler. Den aktive thiolgruppe af cystein i dets molekyle kan give elektroner til ROS, og derefter omdannes GSH til en stabil dimer GSSG for at forhindre ROS i kontinuerligt at gribe elektroner og dermed beskytte proteiner, lipider og nukleinsyrer mod oxidativ skade og opretholde cellernes redoxhomeostase. Dannelsen af GSH i kroppen sker hovedsageligt ad to veje: syntese og reduktion. For det første katalyseres glutaminsyre og cystein af GCLC og GCLM for at danne glutamylcystein, efterfulgt af glutamylcystein og glycin, der katalyseres af GSS for at danne GSH; for det andet kan GSSG reduceres til GSH under påvirkning af NADPH og GSR. Derfor er Gclc, Gclm, Gss og Gsr vigtige enzymgener, der regulerer dannelsen af GSH og er downstream-målgener for Nrf2. Vi fandt, at efter SFN-tilskud var mRNA-transkriptionsniveauerne af glutathionsyntase-gener Gclm, Gss og Gsr i skeletmuskulaturen hos mus i SFN+Cold-gruppen signifikant forøget sammenlignet med PBS+Cold-gruppen, og indholdet af GSH og GSSG var signifikant reduceret. Det spekuleres i, at dette kan være akut lavtemperaturstress, og at SFN-tilskud kan forbedre de novo-syntesen og reduktionsvejene for GSH. GSH spiller dog en vigtig rolle i elimineringen af en stor mængde ROS-produktion forårsaget af akut lavtemperatureksponering, hvilket i sidste ende fører til et betydeligt forbrug af GSH. Ud fra nøgleindikatoren for evaluering af kroppens redoxbalance, GSH/GSSG-forholdet, kan man se, at GSH/GSSG-forholdet i SFN+Kold-gruppen er markant forøget.

Samlet set indikerer denne undersøgelse, at 3-timers akut hypotermi hæmmer Nrf2-medieret antioxidantaktivitet. Før eksponering for lave temperaturer aktiverede indgivelse af sulforafan Nrf2-medierede antioxidantenzymer og glutathion-antioxidantsystemer, hvilket forbedrede skeletmuskulaturens antioxidantkapacitet.