Undersøgelse af den immunmodulerende effekt af saponiner fra Panax ginseng og Panax ginseng på RAW 264.7-celler in vitro
Makrofager, der er involveret i kroppens uspecifikke immunitet, er den første forsvarslinje mod patogener. Aktiverede makrofager kan frigive forskellige inflammatoriske faktorer og cytokiner (såsom NO og TNF - α) for at deltage i kroppens immunrespons og regulere immunresponsen. Forskning har vist, at saponiner i traditionel kinesisk medicin kan aktivere makrofager, forbedre cellernes fagocytiske evne, fremme udskillelsen af relaterede aktive molekyler og opregulere udtrykket af relaterede proteiner. Radix Pseudostellaria fibroblast roots saponins (RPFRS) er en af de bioaktive komponenter, der er isoleret fra ginsengrodderne af Pseudostellaria heterophylla, og som har den virkning, at de forbedrer kroppens immunitet, antioxidation osv. I dag bruges hovedroden af Panax ginseng som medicin, mens rodsilken kasseres, hvilket medfører et stort spild. Forskning har vist, at det gennemsnitlige indhold af totale saponiner i rodsilken fra Panax ginseng er 1,14 gange så højt som i rodknolden. Forskergruppens foreløbige forskning har vist, at ekstraktet af Panax ginseng og Panax ginseng, der hovedsageligt består af saponiner, har en immunbeskyttende effekt på immunsupprimerede mus og kan forbedre deres immunfunktion. På nuværende tidspunkt er der kun få rapporter om immuneffekterne af RPFRS alene, og mononukleære makrofager fra mus (RAW 264.7-celler) bruges ofte som en model til in vitro-immunaktivitetsundersøgelser. Derfor var dette eksperiment målrettet RAW 264.7-celler og undersøgte de immunmodulerende virkninger og mulige mekanismer af RPFRS in vitro ved at opdage immunologiske indikatorer såsom celleproliferation, fagocytisk aktivitet, relaterede cytokiner og mRNA-ekspression. Formålet med undersøgelsen er at berige det immunologiske indhold i RPFRS og skabe et teoretisk grundlag for udvikling og anvendelse af Panax ginseng.

 

Effekten af RPFRS på spredningen af RAW 264.7-celler. Saponiner har visse hæmolytiske og toksiske egenskaber og har lavere toksiske doser sammenlignet med andre planteekstrakter, så man skal være opmærksom på doseringen, når man bruger dem. For at afgøre, om RPFRS har toksiske virkninger på RAW 264.7-celler og screene for den optimale koncentration af RPFRS til eksperimenter, blev MTT-metoden brugt til at bestemme effekten af forskellige koncentrationer af RPFRS på proliferationen af RAW 264.7-celler. Resultaterne af dette eksperiment viste, at RPFRS signifikant kunne fremme spredningen af RAW 264.7-celler i koncentrationsområdet 12,5-800 μ g/mL (P<0,01) og viste et dosis-respons-forhold i koncentrationsområdet 12,5-100 μ g/mL. Derfor blev koncentrationer på 12,5-200 μ g/mL valgt til efterfølgende eksperimenter.

Effekten af RPFRS på den fagocytiske aktivitet af RAW 264.7-celler. Fagocytose er en af makrofagernes vigtigste funktioner. I uspecifik immunitet kan makrofager dræbe eller fordøje patogener i celler, døde celler i kroppen og andre store partikelantigener gennem fagocytose. I specifik immunitet kan de spille en rolle i immunregulering og antigenpræsentation. Der er forskningsrapporter om, at både Platycodon grandiflorus saponiner D og Magnolia grandiflorus saponiner kan forbedre fagocyteringsevnen hos musemakrofager. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser viser resultaterne af dette eksperiment, at RPFRS kan øge OD-værdien af RAW 264.7-cellers fagocytose af neutralt rødt på en dosisafhængig måde ved koncentrationer på 12,5-200 μ g/mL (P<0,01), hvilket indikerer, at RPFRS kan forbedre den fagocytiske aktivitet af RAW 264.7-celler og forbedre deres immunfunktion.

Effekten af RPFRS på udskillelsen af NO og iNOS mRNA-ekspression i RAW 264.7-celler. Makrofager kan eliminere patogener ved at udløse immuninflammatoriske reaktioner og hjælpe kroppen med at regulere specifikke immunresponser, mens NO syntetiseret af nitrogenoxidsyntase (iNOS) er tæt forbundet med dens inflammatoriske immunresponsfunktion. Yang et al. fandt, at proteinhydrolysatet af Panax ginseng kan få RAW 264-celler til at udskille NO og aktivere makrofager med TNF - α, hvilket forbedrer deres immunaktivitet. Resultaterne af dette eksperiment viste, at sammenlignet med den blanke kontrolgruppe kunne RPFRS øge indholdet af NO i supernatanten af RAW 264.7-celler betydeligt (P<0.05), og samtidig blev udtrykket af iNOS i RAW 264.7-celler også øget betydeligt (P<0.01), som begge viste en dosisafhængig stigning. Dette resultat er i overensstemmelse med resultaterne fra Li et al. om, at astragalosid IV kan øge udtrykket af NO og iNOS mRNA i supernatanten fra RAW 264.7-celler.
Effekten af RPFRS på cytokinudskillelse og mRNA-ekspression i RAW 264.7-celler. Cytokiner som IL-6, IL-10, IL-1 β og TNF - α spiller hovedsageligt en rolle i lokale og systemiske inflammatoriske reaktioner. IL-6 kan få B-lymfocytforstadier til at blive antistofudskillende celler. IL-10 kan som en antiinflammatorisk faktor hæmme makrofagaktivitet og inflammatoriske cytokiner som IL-6 og TNF - α. IL-1 β kan fremme aktivering og degranulering af makrofager og neutrofiler samt udtrykket af andre inflammatoriske faktorer. TNF α er det vigtigste pro-inflammatoriske cytokin, der produceres af makrofager som reaktion på forskellige stimuli, hvilket kan fremme udskillelsen af cytokiner som IL-6 og IL-8. Sun et al. fandt, at sojabønnesaponin Ab kan øge niveauerne af TNF - α og IL-1 β i supernatanten af RAW 264.7-celler. Li et al. fandt, at astragalosid IV kan øge niveauerne og mRNA-ekspressionen af IL-6, IL-1 β og TNF - α i supernatanten fra RAW 264.7-celler. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at sammenlignet med den blanke kontrolgruppe kunne RPFRS dosisafhængigt øge niveauerne af IL-6, IL-10, IL-1 β og TNF - α i supernatanten af RAW 264.7-celler. RPFRS øgede også mRNA-ekspressionsniveauerne af IL-6, IL-10, IL-1 β og TNF - α i RAW 264.7-celler i varierende grad, hvilket indikerer, at RPFRS kan regulere deres immunfunktion ved at stimulere udskillelsen af cytokiner.
Effekten af RPFRS på udtrykket af NF-κ B pathway-relaterede proteiner i RAW 264.7-celler. NF-κ B kan som en nuklear transkriptionsfaktor aktivere udtrykket af forskellige gener relateret til tidlige forsvarsreaktioner og derved regulere fysiologiske processer som celleapoptose, immunrespons, inflammation og vævsmodellering. Aktiveringen af NF - κ B-signalvejen stimuleres af forskellige signalmolekyler. TLR2 og TLR4, som er medlemmer af mønstergenkendelsesreceptorfamilien, er stærkt udtrykt på overfladen af makrofager, B-celler og DC-celler og kan overvåge og genkende sygdomsrelaterede molekylære mønstre for at igangsætte signaltransduktion i signalvejen. Sidstnævnte kan også stimulere MyD88 til at udløse en signalkaskade og fremkalde NF-κ B-aktivering. MyD88 og TRIF binder sig til TLR-bindende proteiner i cytoplasmaet, aktiverer MAPK-vejen under påvirkning af ubiquitin, fremmer I κ B - α-phosphorylering for at aktivere NF - κ B-vejen og regulere downstream-genekspression. He et al. fandt, at efter intervention med forskellige doser af totale saponiner fra Platycodon grandiflorum faldt niveauerne af IL-6, IL-1 β og TNF - α i synovialvævet i ankelleddet hos kollageninducerede arthritisrotter, mens niveauerne af TLR2, TLR4, MyD88 og andre proteiner faldt. Shin et al. fandt, at varmebehandlede ginsenosider Rg1 og Rg3 kan fremme udskillelsen af IL-6 og TNF - α i RAW264.7-celler samt phosphorylering af MAPK og nedbrydning af I κ B - α for at aktivere NF - κ B-signalvejen. Resultaterne af dette eksperiment viste, at under virkningen af RPFRS faldt mRNA-ekspressionen af TLR4 i RAW 264.7-celler faldt, mens mRNA-ekspressionen af MyD88 og NF - κ B steg; I overensstemmelse med dette viste resultaterne af WB et fald i ekspressionen af TLR4, I κ B α og cytoplasmatiske NF - κ B-proteiner, mens ekspressionen af TLR2, MyD88, TRIF og nukleare NF - κ B-proteiner steg, hvilket indikerer translokationen af NF - κ B fra cytoplasmaet til kernen. Efter aktivering af NF-κ B-vejen kan den vende transkriptionsinduktionen medieret af proinflammatoriske cytokiner, hvilket svarer til resultaterne af cytokinindhold og mRNA-ekspression nævnt ovenfor. Dette indikerer, at RPFRS kan aktivere RAW 264.7-celler gennem den TLR2- og TLR4-medierede TRIF/MyD88-NF - κ B-transduktionsvej.
RPFRS kan fremme spredning af RAW 246.7-celler, forbedre fagocytisk aktivitet, øge indholdet og mRNA-ekspressionen af relaterede cytokiner, nedregulere mRNA-ekspressionen af TLR4, opregulere ekspressionen af TLR2, MyD88, TRIF og nukleart NF - κ B-protein, nedregulere ekspressionen af TLR4, I κ B - α og cytoplasmatisk NF - κ B-protein og vise en vis dosiseffekt. RPFRS kan udøve immunbeskyttelse ved at hæmme stimuleringen af TLR4 af LPS og kan også aktivere RAW 264.7-celler gennem TLR2/4-MyD88/TRIF-NF - κ B-signalvejen, der deltager i immunresponsprocessen og udøver immunregulerende virkninger. Der er behov for yderligere forskning for at undersøge forholdet mellem RPFRS og andre signalveje, der er involveret i immunregulering af RAW 264.7-celler, samt deres komponenter og immunaktivitet.