Undersøgelse af effekten af baicalin mod kolorektal cancer i HCT116-celler baseret på Hippo-signalvejen
Kolorektal cancer (CRC) er en almindelig ondartet tumor i fordøjelseskanalen. De seneste kræftstatistikker viser, at forekomsten og dødeligheden af CRC er steget hurtigt i verden på grund af aldring, ændrede spisevaner, fedme, rygning og andre faktorer, og ligger på henholdsvis tredje- og andenpladsen. Forekomsten af CRC i de udviklede lande er omkring fire gange højere end i udviklingslandene. Selvom CRC har gjort betydelige fremskridt inden for diagnostiske teknikker og behandlingsmetoder i de senere år, er femårsoverlevelsen stadig mindre end 10%. Kemoterapi er hjørnestenen i antitumorbehandling. 5-Fluorouracil, oxaliplatin, irinotecan og andre almindeligt anvendte lægemidler til behandling af CRC er ofte begrænset i klinisk anvendelse på grund af toksiske bivirkninger som mucositis, knoglemarvsundertrykkelse og dehydrering. Derfor er udforskning af CRC's patogenese og søgning efter terapeutiske lægemidler med lav toksicitet og stærk målretning fortsat i fokus for den nuværende CRC-forskning.
Praksis har vist, at traditionel kinesisk medicin har flere fordele i antitumorbehandling. Den kan ikke kun forbedre effekten af kemoterapimedicin, reducere bivirkninger, vende lægemiddelresistens, men også forbedre prognosen og forbedre patienternes livskvalitet. Desuden indeholder traditionel kinesisk medicin forskellige aktive ingredienser, og forskning har vist, at mange aktive ingredienser kan udøve antitumoreffekter ved at påvirke cellemigration, invasion og apoptose. Derfor har traditionel kinesisk medicin og dens aktive ingredienser gode udviklingsmuligheder til behandling af tumorer. Scutellarin (SCU), en flavonoidforbindelse, der hovedsageligt stammer fra den traditionelle kinesiske medicin Scutellaria baicalensis, Scutellaria baicalensis og Scutellaria baicalensis, har forskellige farmakologiske virkninger såsom antiinflammatorisk, antioxidant, antifibrotisk, neurobeskyttende og kardiovaskulær og cerebrovaskulær beskyttelse. Nylige undersøgelser har vist, at SCU også har omfattende antitumoraktivitet, som kan hæmme forekomsten og udviklingen af forskellige maligne tumorer som kolorektal cancer, levercancer, lungecancer, esophageal pladecellecarcinom osv. Det er et potentielt antitumorlægemiddel.
Hippo-signalvejen er blevet grundigt undersøgt inden for kræftforskning i løbet af det seneste årti. Forskning har bekræftet, at unormal blokade af Hippo-signalvejen er tæt forbundet med overlevelse, spredning, invasion og udvikling af lægemiddelresistens i tumorceller. Når Hippo-signalvejen hæmmes, gennemgår de vigtigste effektorfaktorer i vejen, Yes associated protein (YAP)/Transcription co activator with PDZ binding motif (TAZ) 3, nuklear translokation og aggregerer i kernen, binder til TEA-transkriptionsfaktorer 1-4 og fremmer transkription af downstream-målgener såsom cellecyklusregulator cyclin E1 og onkogen c-Myc. Hippo-signalvejen spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af normal intestinal homeostase og reparation og regenerering af beskadiget væv. Høj YAP/TAZ-aktivitet er ofte en uafhængig prædiktor for dårlig prognose i CRC og er positivt korreleret med tumorstadieinddeling, lymfeknudestatus og metastase. Desuden er unormal aktivering af YAP/TAZ forbundet med fraværet af opstrøms regulerende faktorer i Hippo-signalvejen. Fraværet af mammalian sterol 20 like kinase 1/2 (MST1/2) eller large tumor suppressor 1/2 (LATS1/2) kan føre til varierende grader af aktivering af YAP/TAZ.
Indtil videre er SCU's anti-CRC-effekt blevet bekræftet i flere aspekter. Undersøgelser har vist, at SCU kan udøve sine virkninger gennem forskellige signalveje, herunder Hedgehog, Wnt/β - catenin og andre. Der er dog i øjeblikket ingen forskningsrapport om SCU's anti-CRC-effekt ved at regulere Hippo-signalvejen. Derfor bruger denne undersøgelse hovedsageligt kolorektal cancer HCT116-celler som en in vitro-model til at undersøge virkningerne af SCU på spredning, migration og apoptose af kolorektale tumorceller og udforske dens virkningsmekanisme, hvilket giver reference og eksperimentelt grundlag for udvikling af CRC-terapeutiske lægemidler.

 

Flere og flere beviser tyder på, at SCU kan hæmme forekomsten og udviklingen af tumorer gennem forskellige veje og har potentiale til at blive udviklet til antitumormedicin. Sun et al. fandt, at SCU kan hæmme spredningen af ikke-småcellet lungekræft PC-9 og H1975-celler betydeligt. Forskningsresultaterne fra Han et al. viser også, at SCU kan hæmme spredningen af humane osteosarkom 143B- og U2OS-celler betydeligt på en koncentrationsafhængig måde. I denne undersøgelse reducerede SCU signifikant aktiviteten af kolorektale tumor HCT116-celler, hæmmede cellekloning og hindrede deres spredning, hvilket er i overensstemmelse med ovenstående konklusion.
Ved kræft får kræftceller ofte evnen til at sprede sig og invadere gennem epithelial mesenchymal transition. I hepatocellulært karcinom fandt Liu et al., at SCU kan hæmme epithelial mesenchymal transition af levercancerceller og reducere deres evne til at invadere og metastasere ved at nedregulere aktiviteten af Janus kinase 2 (JAK2)/signaltransducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) signalvej. Li et al. fandt, at SCU i mavekræft kan regulere aktiviteten af PTEN/PI3K-signalvejen, nedregulere ekspressionsniveauerne af E-cadherin i mavekræft MGC-803 og AGS-celler, opregulere ekspressionsniveauerne af vimentin og N-cadherin og hæmme den epitheliale mesenchymale overgang af mavekræftceller. I denne undersøgelse viste resultaterne af cell scratch assay, at sammenlignet med den blanke kontrolgruppe blev migrationshastigheden for HCT116-celler i den SCU-behandlede gruppe signifikant reduceret på en koncentrationsafhængig måde, hvilket indikerer, at SCU har en hæmmende effekt på migrationsevnen for kolorektale tumorceller, hvilket er i overensstemmelse med tidligere forskningsresultater.
Det er i dag en udbredt opfattelse, at utilstrækkelig celleapoptose er en vigtig årsag til tumors opståen og udvikling. Derfor betragtes inducering af tumorcelleapoptose som et effektivt middel til tumorbehandling. Cao et al.s undersøgelse bekræftede, at SCU kan blokere cisplatinresistente lungeadenokarcinom A549-celler i G0/G1-fasen og fremkalde apoptose ved at hæmme AKT/mTOR/4EBP1- og STAT3-vejene. I leverkræft fandt Xu et al., at SCU kan reducere aktiviteten af STAT3-signalvejen ved at hæmme produktionen af reaktive oxygenarter (ROS) i HepG2 leverkræftceller og derved nedregulere ekspressionsniveauerne af downstream-målproteiner BCL-XL og MCL-1 og inducere celleapoptose. På samme måde fandt vi i denne undersøgelse gennem Hoechst 33342/PI-dobbeltfarvning og flowcytometri-detektion, at SCU kan inducere celleapoptose og øge apoptosehastigheden for HCT116-celler betydeligt. Den specifikke reguleringsmekanisme for SCU er dog stadig uklar, så der er foretaget yderligere udforskning i efterfølgende undersøgelser.
Undersøgelser har vist, at Hippo-signalvejen kan deltage i reguleringen af celleproliferation, og overdreven aktivering eller udtryk af YAP kan føre til overdreven celleproliferation i flere væv som f.eks. leveren, mave-tarmkanalen, huden og hjertet. Desuden er YAP og TAZ aktive inducere af epitelial mesenchymal transition i celler. YAP og TAZ med høj aktivitet kan inducere udtrykket af den vigtige transkriptionsregulator ZEB1/2 i epithelial mesenchymal transition og derved fremme epithelial mesenchymal transition. Hippo-signalvejen spiller også en vigtig regulerende rolle i celleapoptose. YAP kan fremme celleapoptose ved at regulere transkriptionen af nedstrøms antiapoptotiske gener som COX-2, Survivor og Glut1; Desuden kan overudtrykt YAP også blokere tumornekrosefaktor, FAS og kemoterapiinduceret apoptose; Undersøgelsen af He et al. bekræftede også, at YAP kan drive AKT-afhængig fosforylering af NR4A1 gennem Ser351, isolere den i kernen og svække dens rolle i fremme af celleapoptose.
Resultaterne af denne undersøgelse viser, at SCU kan opregulere mRNA- og proteinekspressionsniveauerne af MST1 og LATS1 i HCT116-celler, nedregulere mRNA- og proteinekspressionsniveauerne af YAP1 og TAZ, fremme YAP-fosforylering og øge proteinekspressionsniveauet af p-YAP (Ser127). Derfor spekuleres der i, at SCU's rolle kan være relateret til aktiveringen af Hippo-signalvejen. Resultaterne af qRT PCR-detektion viste, at SCU-behandling i 24 timer effektivt øgede mRNA-ekspressionsniveauerne af Bax, caspase-3 og casepase-9 i HCT116-celler, mens mRNA-ekspressionsniveauet af Bcl-2 blev reduceret; Western blot-analyse viste også, at SCU signifikant øgede ekspressionsniveauet af pro-apoptotisk protein Bax og nedsatte ekspressionsniveauet af antiapoptotisk protein Bcl-2 i HCT116-celler. Desuden blev mRNA- og proteinekspressionsniveauerne af c-Myc reduceret betydeligt efter 24 timers SCU-behandling. Ovenstående resultater tyder på, at SCU kan aktivere Hippo YAP/TAZ-kaskaden, fremme YAP/TAZ-fosforylering, hæmme dens transkriptionelle aktivitet, undertrykke ekspressionen af downstream-målgenet c-Myc, reducere ekspressionsniveauet af apoptoseprotein-familiemedlem Bcl-2, øge ekspressionsniveauet af Bax, og migrere ind i mitokondrier for at fremme frigivelsen af cytokrom C og dannelsen af apoptosekompleks og derved aktivere den apoptoseinitierende faktor caspase-9 i caspasefamilien og downstream apoptoseudførende faktor caspase-3, hvilket i sidste ende inducerer celleapoptose gennem den mitokondrielle vej, hindrer væksten af kolorektale kræftceller og udøver anti-kolorektal cancereffekter.
Sammenfattende viste denne undersøgelse, at SCU kan hæmme spredningen og migrationen af HCT116-celler med kolorektal cancer betydeligt og fremkalde celleapoptose. Dens virkningsmekanisme kan være relateret til aktivering af Hippo-signalvejen. I betragtning af de komplekse årsager til dannelse af kolorektal cancer og forskellene mellem tumorcellelinjer fra forskellige kilder skal SCU's anti-kolorektale cancereffekt dog stadig valideres på flere andre kolorektale cancercellelinjer og yderligere undersøges grundigt gennem in vivo dyreforsøg. Derudover er det blevet rapporteret, at Wnt-, Notch-, Hedgehog- og BMP-signalveje alle kan deltage i reguleringen af tarmens homeostase og regenerering, og undersøgelser har vist, at Hippo-signalvejen kan interagere med disse veje, hvilket fører til crosstalk. Derfor er det nødvendigt yderligere at undersøge, om SCU udøver sin effekt mod kolorektal cancer ved omfattende at regulere aktiviteten af Hippo-signalvejen og dens crosstalk-vej.