Samtidig bestemmelse af seks flavonoider i Wuyao-blade ved hjælp af ultrahøjtydende væskekromatografi-tandem-massespektrometri
Lindera aggregata (Sims) Kosterm, en plante, der tilhører kamferfamilien og Piper-slægten, har antiinflammatoriske, smertestillende, antioxiderende og antitumorale virkninger. Den produceres hovedsageligt i Kinas sydøstlige kystprovinser, hvor Tiantai County i Zhejiang-provinsen er den mest berømte, og derfor kaldes den Tiantai Wuyao. I 2018 blev den udvalgt som en af de nye "Zhejiang Eight Flavors" i Zhejiang. Moderne farmakologisk forskning har vist, at sort medicin også har immunmodulerende virkninger på centralnervesystemet og det kardiovaskulære system, hvilket gør markedsudsigterne brede. De medicinske dele af Wuyao vokser dog langsomt og er ofte 8-10 år om at opfylde kravene til behandling af medicinske urter af høj kvalitet. I løbet af vækstcyklussen kasseres stængel- og bladdele ofte, hvilket resulterer i lav ressourceudnyttelse. I de folkelige områder i Zhejiang bruges Wuyao-blade ofte til at behandle akut cellulitis, reumatoid arthritis og andre betændelser, og de laves også ofte til tedrikke for at sænke fedtindholdet, beskytte leveren og have andre sundhedsmæssige fordele. Tidligere undersøgelser har vist, at Wuyao-bladekstrakter har en vis lipidsænkende effekt. Forskerteamet gennemførte en farmakologisk korrelationsundersøgelse af Wuyao-bladekstrakter og fandt, at de har en bestemt virkningsmekanisme mod hyperlipidæmi og osteoporose. Samtidig blev der også udført systematisk kemisk komponentseparation og ekstraktion af Wuyao-blade i den tidlige fase. Seks flavonoider blev isoleret for første gang fra ethanolekstraktet af Wuyao-blade, som blev identificeret som: kaempferol-3-O - α - L-rhamnoside (1), quercetin (2), kaempferol-3-O - β - D-xyloside (3), kaempferol-3-O - α - L-arabinofuranoside (4), kaempferol-3-O - (2 ″ -3-O-trans-3-O-p-3-O-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (5), kaempferol-3-O - (2 ″, 4 ″ -3-O-di-3-3-O-3-3-O-di-3-glukosid) O-trans-3-O-p-3-O-coumaroyl) - α - L-rhamnosid (6), kemisk struktur vist i figur 1.

På nuværende tidspunkt findes der relevante forskningsrapporter om kvalitetsevaluering af Wuyao-blade. Yi et al. brugte HPLC til at bestemme indholdet af fire flavonoider i Wuyao-blade fra forskellige oprindelser i Hunan-provinsen. Sun et al. brugte UV-spektrofotometri til at bestemme det samlede flavonoidindhold i Wuyao-bladekstrakter og undersøgte de relevante faktorer for udvinding af samlede flavonoider for at optimere udvindingsprocessen. Samtidig brugte Sun et al. HPLC til at bestemme indholdet af fire sesquiterpenoidlaktoner i Wuyao-blade fra forskellige oprindelser. Dette er dog traditionelle detektionsmetoder, som mangler høj effektivitet og nøjagtighed i indholdsbestemmelsen. Med udviklingen af massespektrometri-teknologien er der blevet udviklet ultrahøjtydende væskekromatografi-tandem-massespektrometri-teknologi med høj effektivitet, høj specificitet og høj følsomhed. Kromatografi-tandem-massespektrometri (UPLC-MS/MS) er blevet en vigtig analysemetode til at påvise kvaliteten af traditionelle kinesiske medicinske materialer. Derfor vil denne undersøgelse bruge UPLC-MS/MS-teknologi til kvantitativt at undersøge de seks vigtigste flavonoider i Wuyao-blade fra forskellige oprindelser og kombinere entropivægten - α - L-approximate ideal solution ranking method (TOPSIS) til analyse og evaluering for at tilvejebringe et videnskabeligt grundlag for den interne kvalitetskontrol af Wuyao-blade.

 

Valg af ekstraktionsbetingelser. I denne undersøgelse blev UPLC-MS/MS-metoden brugt til samtidig at bestemme indholdet af seks indikatorforbindelser, nemlig kaempferol-3-O - α - L-rhamnosid (1), quercetin (2), kaempferol-3-O - β - D-xyloside (3), kaempferol-3-O - α - L-arabinofuranosid (4), kaempferol-3-O - (2"- trans - p-coumaroyl) - α - L-rhamnosid (5) og kaempferol-3-O - (2", 4"- di trans - p-coumaroyl) - α - L-rhamnosid (6), i Wuyao-blade inden for 10 minutter. Methanolkoncentrationerne var henholdsvis 30%, 50% og 70%. Baseret på analysen af spektret blev 70%-methanol valgt for at opnå den bedste ekstraktionseffekt. Samtidig blev der foretaget en sammenligning mellem opvarmning af tilbagesvaling og ultralydsekstraktionsmetoder. Baseret på indholdsresultaterne var de opnåede ekstraktionshastigheder sammenlignelige. I betragtning af tid og forbrugsomkostninger blev ultralydsekstraktion vedtaget.
Betingelser for kromatografi og massespektrometri. Dette studie undersøgte tre mobilfasesystemer: acetonitrilvand, acetonitril-0,1% myresyrevand og acetonitril-0,1% ammoniumformiatvand. Peakområdet og peakformen for seks flavonoider blev brugt som evalueringsindikatorer til at bestemme det passende mobilfasesystem. Det blev konstateret, at når acetonitrilvand blev valgt som den mobile fase, var der et tailing-fænomen i forbindelserne af kaempferol-3-O - (2 "- trans-pcoumaroyl) - α - L-rhamnosid og kaempferol-3-O - (2", 4 "- di-trans-pcoumaroyl) - α - L-rhamnosid; Når acetonitril 0.1% ammoniumformiatvand vælges som den mobile fase, udviser quercetin 3-O - α - L-arabinofuranosid let tailing; Når acetonitril 0,1% myresyrevand blev valgt som den mobile fase, var topformerne for alle seks forbindelser relativt symmetriske. Derfor blev acetonitril 0,1% myresyrevand valgt som mobilfasesystem. Ved valg af massespektrometribetingelser anvendte undersøgelsen positive og negative iontilstande til at bestemme indholdet af seks målforbindelser. For at sikre, at målforbindelserne har bedre stabilitet, højere responsværdier og bedre topformer, har flere gentagne eksperimenter vist, at brug af negativ ionscanningstilstand til detektion kan gøre de seks flavonoidforbindelser mere stabile med bedre topformer og responsværdier under detektionsbetingelserne. Samtidig var retentionstiderne for flavonoiderne 2 og 5, der blev ekstraheret fra ionkromatogrammet i figur 2, stort set de samme under undersøgelsen af kromatografi- og massespektrometribetingelserne. Sammenlignet med traditionelle HPLC-analyseteknikker er kromatografi-massespektrometri baseret på masse-til-ladningsforholdsanalyse ikke afhængig af top-til-top-separation og har kort signalopsamlingstid og høj følsomhed. I denne undersøgelse blev UPLC-MS/MS-analyseteknologi derfor brugt til samtidig at bestemme seks flavonoider i Wuyao-blade, hvilket har flere fordele.
Analyse af resultater. Denne undersøgelse indsamlede medicinske prøver fra 10 Wuyao-produktionsområder i Kina og brugte UPLC-MS/MS-teknologi til samtidig at bestemme indholdet af seks kemiske komponenter i Wuyao-blade. TOPSIS-metoden med entropivægt blev brugt til omfattende at analysere og evaluere de seks forbindelser fra de 10 produktionsområder. Den omfattende rangordning var som følger: Tiantai, Zhejiang>Jinhua, Zhejiang>Changsha, Hunan>Ningde, Fujian>Kunming, Yunnan>Tonglu, Zhejiang>Guilin, Guangxi>Yingtan, Jiangxi. Resultaterne viste, at den omfattende kvalitet af Wuyao-blade i Tiantai, Zhejiang var relativt høj, hvilket er relateret til den traditionelle tro på, at Tiantai, Zhejiang er et ægte produktionsområde for Wuyao-medicinske materialer. Samtidig bekræfter det også optegnelsen i Compendium of Materia Medica, at for Wuyao er Tiantai vinderen; Dictionary of Traditional Chinese Medicine registrerer, at produktionen af Wuyao er den største i Zhejiang, og kvaliteten af de produkter, der produceres i Tiantai, Zhejiang, er den bedste, og derfor kaldes den "Tiantai Wuyao" eller "Tai Wuyao". Samtidig afspejler evalueringsresultaterne også, at der er betydelige forskelle i indholdet af de seks vigtigste flavonoider i Wuyao-blade fra forskellige oprindelser, og der er også betydelige forskelle i Wuyao-blade fra forskellige byer i den samme provins. Dette kan være relateret til kilderne til Wuyao-introduktion i forskellige plantebaser og forskellige økologiske miljøer.
På nuværende tidspunkt er Wuyao Ye blevet godkendt som en ny ressourcefødevare, så dens produktudvikling vil fortsat blive udforsket. Denne undersøgelse har etableret en metode, der er nem at betjene, har god præcision, stabilitet og repeterbarhed, og som samtidig kan bestemme indholdet af seks flavonoider i Wuyao Ye. Den kan bruges til kvantitativ analyse og omfattende evaluering af de vigtigste flavonoider i Wuyao Ye, og den anvendte TOPSIS-metode med entropivægt giver også et teoretisk grundlag for at evaluere kvaliteten af andre lægeurter med medicinsk værdi.