Fremstilling af γ-polyglutaminsyre og undersøgelse af dens tyrosinasehæmmende aktivitet
Polymerer som homopolymerer af aminosyrer har en bred vifte af biologiske funktioner, biokompatibilitet og spredt molekylvægtfordeling. På nuværende tidspunkt omfatter homopolymer-aminosyrer fremstillet af mikroorganismer hovedsageligt tre typer: polyglutaminsyre (poly - γ - glutaminsyre, γ - PGA), ε - polylysin (ε - PL) og cyanophycin. Gamma-PGA, som er en af dem, har også sine fremragende biologiske egenskaber. Siden 1913 har forskere successivt isoleret gamma-PGA fra slim fra natto-mad og fermenteringsmedier fra Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. megaterium og B. anthracis. Konformationsstrukturen af γ-PGA ændrer sig markant med opløsningens pH-værdi, koncentration og ionstyrke. Produktionen af γ-PGA af Bacillus subtilis udviser parallelle β-foldningsstrukturer i sure opløsninger, uregelmæssige krøllede strukturer, når man nærmer sig neutralitet, og tilfældige udvidede strukturer i alkaliske miljøer.

Det færdige produkt af γ-PGA er et hvidt lugtfrit pulver med en molekylvægt på mellem 100 og 10000 kDa, svarende til ca. 50 til 50000 glutaminsyre-monomerer. Gamma-PGA og dets derivater har brede forsknings- og anvendelsesmuligheder inden for mange områder. De bruges f.eks. som konserveringsmiddel i fødevarer, som fugtgivende ingrediens i kosmetik, som bærestof til langsom frigivelse af lægemidler, som adsorbent for tungmetaller og som flokkuleringsmiddel til vandbehandling. I 2013 fandt forskere ud af, at gamma-PGA reducerer niveauet af reaktive iltarter og nitrogenoxid i B16-celler, øger katalaseaktiviteten og hæmmer Forsklin-induceret tyrosinaseaktivitet og melaninproduktion. Dette er den første rapport om den anti-melanogenetiske effekt af γ-PGA.

Molekylvægt er en vigtig karakteristisk parameter for polymerer, og dens størrelse bestemmer dens anvendelsesområde og effektivitet. Derfor er det af stor betydning at fremstille forskellige molekylvægte af gamma-PGA og undersøge aktivitetsforskellene mellem forskellige molekylvægte for at udvide anvendelsesområdet for gamma-PGA. På nuværende tidspunkt er mikrobiel fermentering en almindeligt anvendt metode til gamma-PGA-fermentering. Molekylvægten og udbyttet af γ-PGA fremstillet ved denne metode påvirkes af de producerende bakterier. Alt efter om der tilsættes glutaminsyre under fermenteringsprocessen, inddeles de producerende stammer af γ-PGA i to kategorier: glutaminsyreafhængige stammer og ikke-glutaminsyreafhængige stammer. Undersøgelser har vist, at brug af glutamatafhængige stammer som producerende bakterier resulterer i højere produktion af gamma-PGA. Derfor bruger denne artikel Bacillus subtilis som fermenteringsstamme til at producere γ-PGA gennem mikrobiel fermentering. Fem grupper af forskellige molekylvægte af γ-PGA blev fremstillet ved at kombinere kemiske nedbrydningsmetoder, og deres intracellulære og ekstracellulære hæmning af tyrosinaseaktivitet blev undersøgt. At lægge grundlaget for anvendelsen af forskellige molekylvægte af gamma-PGA som blegemidler inden for kosmetik.

Gamma-PGA er et ekstracellulært udskilt produkt. I lang tid har der været udført omfattende forskning i dets egenskaber, bakterieforbedring og genetiske egenskaber, fermenteringsproces og ekstraktion og rensning. Molekylvægten af γ-PGA har direkte indflydelse på dets anvendelse inden for mange områder. Da forskere opdagede, at gamma-PGA har anti-melanineffekter, er gamma-PGA gradvist blevet en potentiel ingrediens i blegemidler.
At reducere produktionen af melanin er et vigtigt skridt for at opnå blegende effekter. Akkumuleret forskning har vist, at tyrosinase er et vigtigt hastighedsbegrænsende enzym, der er involveret i processen med melaninproduktion, og dets ekspressionsniveau og aktivitet bestemmer hastigheden og udbyttet af melaninsyntesen. Derfor screenes dets hæmmere normalt som blegemidler. I 2004 opdagede Sasaki et al., at metallothionein effektivt kan hæmme melaninproduktionen stimuleret af NO og andre melanogener ved direkte at hæmme tyrosinaseaktiviteten i melanosomer. I 2013 opdagede Jeong et al., at ginsenosid Rh4-aglykon (A-Rh4) hæmmer melaninsyntesen i B16-melanomceller gennem proteinkinase A-vejen. En stigning i tyrosinaseaktivitet blev observeret i melaninsyntese, og dens nedregulering kan hæmme melaninproduktionen. Derfor er søgen efter naturlige biomaterialer med anti-tyrosinase-aktivitet blevet betragtet som en vigtig strategi for udvikling af nye produkter til regulering af hudpigmentering.
Denne artikel vælger glutaminsyreafhængig Bacillus subtilis som stamme til fermenteringspræparat af γ-PGA med et udbytte på 8 g/l og et indhold på 97,69%. Ved at udnytte dens følsomhed over for fysiske og kemiske forhold i strukturen og kombinere kemiske nedbrydningsmetoder blev der fremstillet fem forskellige molekylvægte af γ-PGA med vægtgennemsnitlige molekylvægte på 21, 117, 282, 432 og 501 kDa. For at sikre cellernes biologiske sikkerhed blev det sikre koncentrationsområde, som cellerne kan bruge, først evalueret. Derefter blev tyrosinase-aktivitetsinhiberingen brugt som indikator til at bestemme tyrosinase-aktivitetsinhiberingen af fem forskellige molekylvægte af γ-PGA både i og uden for cellen. De omfattende resultater af cytotoksicitet og tyrosinasehæmmende aktivitet viste, at alle fem molekylvægte af γ-PGA havde tyrosinasehæmmende aktivitet, og den ekstracellulære hæmmende aktivitet af tyrosinase steg med stigningen i molekylvægt, hvilket giver et teoretisk grundlag for den fremtidige anvendelse af γ-PGA som en potentiel blegende ingrediens.
Molekylvægten af γ-PGA fremstillet ved mikrobiel fermenteringsmetode er begrænset. Jiang et al. konstruerede en rekombinant Bacillus subtilis, der indeholder γ - PGA-nedbrydende enzymgenklynge pgsBAE, som kan syntetisere lavmolekylær (ca. 10 kDa) γ - PGA. Qiao Changsheng et al. brugte en fermenteringstank til at fermentere og fremstille 1000kDa γ - PGA ved at regulere fermenteringsprocessen og optimere fermenteringsbetingelserne. Derfor er det næste skridt at kombinere genteknologi og andre metoder til at konstruere ingeniørstammer ved at indføre vigtige genfragmenter af nedbrydningsenzymer eller synteseenzymer for at fremstille gamma-PGA med højere eller lavere molekylvægt for yderligere at undersøge dets blegeaktivitet.
På nuværende tidspunkt er naturlige ingredienser blevet tilsat som blegemidler i kosmetiske formler, herunder quercetin, arbutin, niacinamid, astaxanthin, salicylsyre, frugtsyre osv. Forskellige whitening-ingredienser har forskellige whitening-aktiviteter på grund af deres forskellige whitening-mekanismer. Den samme blegende ingrediens har også forskellige effekter i kosmetik på grund af de forskellige koncentrationer, der tilsættes. Derfor giver undersøgelsen af polyglutaminsyre med forskellige molekylvægte ikke kun en potentiel blegende ingrediens til kosmetikområdet, men den kan også føjes til kosmetiske formler for at udøve forskellige effekter baseret på forskellene i blegningsaktivitet mellem forskellige molekylvægte, tilpasse sig forskellige populationer og imødekomme deres blegningsbehov. Ved at forbedre udvindingsteknologien for naturlige ekstrakter kan man i fremtiden udføre kvalitative og kvantitative analyser af de aktive ingredienser i ekstrakterne for at bestemme deres virkninger og finde de aktive stoffer med den bedste blegningseffekt i naturlige organismer.