Iskæmisk cerebrovaskulær sygdom omfatter to typer: forbigående iskæmisk slagtilfælde og hjerneinfarkt. Blandt dem kaldes hjerneinfarkt iskæmisk slagtilfælde (IS) i traditionel kinesisk medicindiagnose, som er en sygdom forårsaget af forskellige årsager, der fører til lokale blodforsyningsforstyrrelser i hjernevævsregioner, hvilket resulterer i iskæmiske og hypoxiske læsioner og nekrose af hjernevæv og efterfølgende producerer en række neurologiske funktionsforstyrrelser. Den høje dødelighed og invaliditet samt de komplekse patologiske mekanismer påfører hvert år verden en betydelig økonomisk byrde. Oxygen-glukose-berøvelse (OGD) i hjerneceller er den mest anvendte in vitro-model for iskæmisk slagtilfælde og bruges i vid udstrækning i grundlæggende og præklinisk forskning i slagtilfælde.
Autofagi er udbredt i eukaryote celler og spiller en vigtig rolle i reguleringen af cellernes overlevelses- og dødsprocesser. Et stort antal undersøgelser tyder på, at autofagi er tæt forbundet med forekomsten og udviklingen af iskæmisk hjerneskade. Nogle undersøgelser har vist, at neuronal autofagi kan lindre iskæmisk hjerneskade, mens andre har rapporteret, at neuronal autofagi kan forværre iskæmisk hjerneskade, men den specifikke mekanisme er stadig uklar.
β-nikotinamidmononukleotid (NMN) findes i forskellige fødevarer og er afgørende for regulering af cellulær aldring og opretholdelse af normale kropsfunktioner. Det deltager i transduktionen af mange vigtige intracellulære signalveje. Der er forskningsrapporter om, at indgivelse af NMN in vitro hurtigt kan omdanne det til NAD+ for at regulere cellernes aldring og opretholde normale kropsfunktioner. NMN kan kompensere for faldet i NAD+ forårsaget af IS og forbedre neuronal skade ved cerebral iskæmi. Det tyder på, at NMN spiller en vis rolle i IS. Undersøgelser har vist, at NMN kan fremme neurovaskulær regenerering, forbedre hjernens mikrovaskulære endotelfunktion, antiinflammatoriske og anti-apoptotiske virkninger. Der er også nogle få undersøgelser, der tyder på, at NMN kan udøve antiiskæmiske hjerneskadevirkninger ved at regulere autofagi, men den specifikke mekanisme, hvormed NMN regulerer autofagi og anti IS, er endnu ikke klar.
Formålet med denne undersøgelse er at konstruere en PC12-cellemodel med ilt- og glukosemangel. Celleoverlevelse blev målt ved MTT-assay in vitro, autofagosomer og autolysosomer blev påvist ved transmissionselektronmikroskopi, autofagosomfluorescensintensitet blev observeret ved MDC, og autofagirelateret proteinekspression af LC3-II/LC3-I, Beclin1, p62 og P-mTOR/mTOR blev påvist ved Western blot. Formålet er at afklare effekten af NMN på OGD-induceret autofagisk skade i PC12-celler.

Lancet-undersøgelsen fra 2017 viste, at slagtilfælde er den vigtigste sygdom, der forårsager mange års tab af liv i Kina, med hurtig sygdomsprogression, høj dødelighed og invaliditet. Blandt dem tegner IS sig for 60% til 70% af alle slagtilfælde, hvilket skyldes vaskulær obstruktion, der fører til et fald i blodtilførslen til et bestemt område af hjernen. Efter cerebral iskæmi og hypoxi kan det udløse en række patologiske og fysiologiske reaktioner såsom autofagi, apoptose, oxidativ stress og intracellulær calciumoverbelastning. Den lange restitutionscyklus for IS-overlevere har øget den globale økonomiske byrde. På nuværende tidspunkt er der mange kontraindikationer for lægemidler, der anvendes på markedet til forebyggelse og behandling af IS. Derfor er det nødvendigt løbende at udforske lægemidler til forebyggelse og behandling af IS. OGD er en klassisk model til at studere IS in vitro. PC12-cellelinjen er en af de mest anvendte cellelinjer til undersøgelse af neuronal skade, og den bruges ofte til forskning i iskæmi og hypoxisk skade. Derfor brugte dette eksperiment OGD PC12-cellemodellen til in vitro-forskning.
NMN er et naturligt forekommende stof i menneskekroppen og findes også i mange fødevarer med en molekylvægt på 334,22. Det er et produkt af nikotinamid-phosphoribosyltransferase-reaktionen og også en af de vigtigste forstadier til NAD+. Undersøgelser har vist, at regulering af niveauerne af NMN i organismer har gode terapeutiske og reparerende virkninger på hjerte-kar- og cerebrovaskulære sygdomme, neurodegenerative sygdomme og aldersrelaterede degenerative sygdomme. Der er også forskningsrapporter om, at indgivelse af NMN kan reducere infarktstørrelsen og den neurologiske skade i MCAO-modeller med rotter. I dette eksperiment blev MTT-assay brugt til at demonstrere, at OGD kan reducere PC12-cellers overlevelsesrate. NMN kan øge overlevelsesraten for OGD PC12-celler ved koncentrationer på 400, 800 og 1600 μ mol/L, med den højeste overlevelsesrate observeret ved en koncentration på 800 μ mol/L; Der var dog ingen signifikant forskel i celleoverlevelsesraten mellem NMN200 og 3200 μ mol/L koncentrationer, hvilket indikerer, at 200 μ mol/L koncentration endnu ikke har nået den effektive koncentration til forbedring af OGD-induceret PC12-celleoverlevelsesrate, mens 3200 μ mol/L koncentration kan have forårsaget visse skader på cellerne på grund af overdreven koncentration.
Autofagi, også kendt som type II programmeret celledød, henviser til den proces, hvor celler under regulering af autofagirelaterede gener bruger lysosomer til at nedbryde beskadigede, denaturerede eller aldrende makromolekyler og organeller for at opretholde deres overlevelse, differentiering, vækst og stabilitet. Forskning viser, at autofagi induceres efter IS, og at autofagi også forekommer og udvikler sig med den patologiske proces af IS og spiller forskellige regulerende roller i de akutte, subakutte, restituerende og efterfølgende stadier af IS.
MTOR er en atypisk serin/threonin-proteinkinase med en relativ molekylvægt på 289 kDa. Bindingen af forskellige proteiner kan danne to forskellige komplekser, nemlig mTORCl og mTORC2. MTORCl er følsom over for rapamycin og er ansvarlig for at integrere vækstfaktorer og næringssignaler, primært regulering af cellulær autofagi, ribosombiogenese, proteinoversættelse og lipidsyntese. MTORT betragtes som en ventil for autofagi. Forskning har vist, at fosforyleret mTOR kan afhjælpe skader som følge af oxidativ glukosemangel og spille en beskyttende rolle i cellerne. 3-MA er en almindeligt anvendt autofagi-hæmmer. RAPA er en mTOR-hæmmer, der kan fremkalde autofagi ved at hæmme mTORC1, også kendt som en autofagiaktivator. I dette eksperiment blev der oprettet 3-MA- og RAPA-grupper for at gribe ind og regulere OGD-induceret autofagi i PC12-celler; samtidig blev der også oprettet 3-MA-, RAPA- og lægemiddelkombinationsgrupper for at observere, om NMN kunne modvirke virkningerne af 3-MA eller RAPA på OGD-induceret autofagi i PC12-celler.
Niveauerne af Beclin-1-, LC3- og p62-proteiner kan fungere som vigtige indikatorer for autofagi. Beclin1 er en moden autofagi-regulator, der er positivt korreleret med autofagi. Beclin1 interagerer med proteiner som VPS15, VPS34, ATG14 for at udføre autofagi og membrantransportfunktioner. LC3 er en homolog af den ubiquitinlignende modifikator ATG8 i gær, som menes at spille en rolle i autofagi. Efter behandling med ATG4 mister LC3 sin C-terminale rest og omdannes til LC3-I. LC3-I gennemgår en kaskade af ubiquitinationslignende enzymatiske reaktioner, der er kovalent forbundet med lipidmolekylet phosphatidylethanolamin på autofagosommembranen og omdannes til LC3-II. En stigning i LC3-II/LC3-I-forholdet indikerer en stigning i autofaginiveauet. P62 er et markørprotein, der afspejler autofagiaktivitet, og dets proteinniveau er negativt korreleret med autofagi. Det vil sige, at når autofagi forekommer, nedbrydes p62-protein kontinuerligt i cytoplasmaet; Når autofagi-aktiviteten svækkes, og autofagi-funktionen er nedsat, vil p62-protein kontinuerligt ophobes i cytoplasmaet. Dette eksperiment bekræftede gennem Western blot-teknologi, at NMN kan nedregulere de relative ekspressionsniveauer af Beclin1- og LC3-II/LC3-I-proteiner og opregulere ekspressionsniveauerne af P-mTOR/mTOR- og p62-proteiner. Derudover blev transmissionselektronmikroskopi og MDC-metoden brugt til at bekræfte, at NMN kan reducere antallet og intensiteten af autofagosomer og autolysosomer i OGD PC12-celler. Ovenstående indikerer, at NMN kan hæmme OGD-induceret autofagi i PC12-celler.
Sammenfattende tyder det på, at en vis dosis NMN kan modvirke OGD-induceret autofagisk skade i PC12-celler og derved udøve en cellulær beskyttende effekt, og denne beskyttende effekt kan være relateret til mTOR-relaterede veje. Denne undersøgelse kan give en bestemt målreference til forebyggelse og behandling af OGD-induceret autofagisk skade af NMN og akkumulere laboratoriedata til udvikling af naturlig sammensat NMN.